Die Bändigung der Stoffwechsel-Komplexität

Mit Hilfe von CRISPRi-Screens sind Forschende den Ursachen der metabolischen Robustheit von E.coli auf der Spur

24. November 2020

Robustheit, die Fähigkeit des Stoffwechsels, die Änderungen in seiner Umgebung abzupuffern, ist in der mikrobiellen Forschung nicht immer willkommen. Sie erschwert die Beeinflussung von Stoffwechselvorgängen und kann verhindern, dass Antibiotika Bakterien abtöten. Deshalb ist es wichtig, die Mechanismen zu verstehen, die metabolische Robustheit ermöglichen. Ein massiv paralleler CRISPRi-Screen zeigte, dass der Metabolismus von E. coli sehr robust gegen den Knockdown von Enzymen ist, und Multiomik-Daten enthüllten die Mechanismen dahinter. In Zukunft können die Ergebnisse helfen, bessere Modelle des Stoffwechsels zu erstellen, um eine gezielte Entwicklung von industriell nutzbaren Mikroben zu ermöglichen.

Die CRISPR-Interferenz verwendet ein deaktiviertes Cas9-Protein (dCas9) und eine einzelne Leit-RNA (sgRNA) und ermöglicht spezifische Knockdowns von Enzymen im metabolischen Netzwerk von Bakterien. Die Tiefensequenzierung kann das Wachstum von 7177 CRISPRi parallel verfolgen und informiert über die Robustheit jedes CRISPRi-Stamms.

In ihrem natürlichen Lebensraum sind Bakterien wie E. coli mit ständigen Veränderungen in der Zusammensetzung der Nährstoffe konfrontiert. Doch unter Laborbedingungen erweisen sie sich als regelrechte Spezialisten. Hier sind sie in der Lage, aus einer einzigen Kohlenstoffquelle, wie Glukose, alle notwendigen Zellbausteine zu bilden. Diese Aufgabe erfordert, dass Hunderte von enzymkatalysierten Reaktionen im richtigen Tempo ablaufen und keine Reaktion versehentlich unter eine kritische Schwelle fällt. Andernfalls kann ein einziger Engpass im Stoffwechsel-Netzwerk weitreichende Folgen haben und schließlich das Zellwachstum stoppen.

Um zu verstehen, wie E. coli diese Aufgabe erfüllt, nutzten Forscher unter der Leitung von Hannes Link vom Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie die CRISPR-Interferenz-Technologie (CRISPRi). Sie induzierten Knockdowns jedes Proteins im metabolischen Netzwerk von E. coli und schufen damit eine CRISPRi-Bibliothek mit 7177 Stämmen. Sequenzierung der CRISPRi-Bibliothek ermöglichte die Verfolgung der Fitness jedes CRISPRi-Stamms über einen Zeitraum von 14 Stunden. Die Ergebnisse dieses CRISPRi-Fitness-Tests waren überraschend: Nur im Falle von sieben Genen – Schlüsselpunkten im metabolischen Netzwerk, wie die Biosynthese von Desoxynukleotiden für die DNA-Synthese – verursachte das Ausschalten des Gens sofortige und starke Fitnessdefekte. Dagegen hatten Hunderte von anderen Knockdowns nur geringe Auswirkungen.

Die Ergebnisse zeigten, dass E. coli-Zellen eine sehr hohe metabolische Robustheit besitzen. "Im Allgemeinen ermöglicht es die Robustheit lebenden Organismen, trotz äußerer und innerer Störungen zu überleben, und es gibt verschiedene Mechanismen, die das ermöglichen, wie z.B. Rückkopplungsmechanismen oder Redundanz. In diesem Zusammenhang befinden sich Organismen immer in einer Kompromisssituation: entweder sie exprimieren hohe Enzymkonzentrationen, was kostspielig ist, oder sie exprimieren niedrige Enzymkonzentrationen, was die Leistung des Stoffwechsels begrenzen kann. Für uns Forscher ist Robustheit bei Bakterien nicht immer ein willkommenes Merkmal, zum Beispiel wenn wir den Stoffwechsel so gestalten wollen, dass Chemikalien in Bakterien im Rahmen biotechnologischer Anwendungen überproduziert werden. Deshalb ist es wichtig zu verstehen, wie E.coli diese Aufgabe erfüllt", so Hannes Link.

Dazu hat das Team das Proteom und Metabolom von 30 CRISPRi-Stämmen gemessen. Bei einigen Stämmen zeigten die Reaktionen des Proteoms Mechanismen, die die CRISPRi-Knockdowns aktiv pufferten. Zum Beispiel verursachte der Knockdown der Homocystein-Transmethylase (MetE) im Methionin-Biosyntheseweg eine kompensatorische Hochregulation aller benachbarten Enzyme. Mit anderen Worten: die E. coli-Zellen nahmen wahr, dass der Knockdown einen Engpass in der Methionin-Biosynthese verursachte, und operierten dann sehr präzise und lokal um den Methionin-Weg herum. Die anderen 30 CRISPRi-Stämme zeigten ähnliche Puffermechanismen, die überraschend spezifisch waren. Ob alle Stoffwechselwege mit solch präzisen und lokalisierten Puffermechanismen ausgestattet sind, bleibt offen. Daher entwickeln die Forschenden derzeit neue Massenspektrometrie-Methoden, um den gesamten Metabolismus der gesamten CRISPRi-Bibliothek zu untersuchen.

Dieser umfangreiche Ansatz eröffnet neue Wege in der Entwicklung industriell nutzbarer Mikroben, wie Hannes Link aufzeigt: "In Zukunft wollen wir diese Daten nutzen, um Stoffwechselmodelle zu konstruieren, die dynamisch und prädiktiv sind. Wir haben in der aktuellen Studie ein sehr kleines dynamisches Modell verwendet, aber die Erstellung größerer Modelle bleibt eine der großen Herausforderungen. Solche Modelle würden es uns erlauben, E. coli-Zellen zu konstruieren, die auf ein bestimmtes Signal hin aufhören zu wachsen, und dann alle Stoffwechselressourcen auf die Synthese einer gewünschten Chemikalie konzentrieren. Diese kontrollierte Abkopplung des Wachstums von der Überproduktion würde neue Wege im Metabolic Engineering beschreiten und neue Anwendungen in der industriellen Biotechnologie ermöglichen."

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