Forschungsbericht 2008 - Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie

Lymphozytenentwicklung aus Stammzellen

Lymphocyte development from stem cells

Autoren
Melchers, Fritz
Abteilungen

Lymphozytenentwicklung (Melchers) (Prof. Dr. Dr. h. c. Fritz Melchers)
MPI für Infektionsbiologie, Berlin

Zusammenfassung
Alle wesentlichen Zellen des Blutes können aus den embryonalen Stammzellen der Maus entwickelt und durch Transplantation in Empfängermäuse eingeführt werden. Damit ist es möglich geworden, den Einfluss einer größeren Anzahl von Genen mit unterschiedlichen Funktionen bei der Bildung des angeborenen und des adaptiven Immunsystems unter natürlichen Bedingungen zu untersuchen. Weil ein defektes Gen in embryonalen Stammzellen durch die intakte Form desselben Gens durch so genannte homologe Rekombination ersetzt werden kann, lassen sich Immundefekte sogar fehlerlos reparieren.
Summary
All essential blood forming cells can be generated from the embryonic stem cells of mice and retransplanted into recipient mice. The influence of a larger number of genes with different functions during the generation of the innate and adaptive immune system can thus genetically be studied under natural conditions. Since in embryonic stem cells a defect gene can be replaced by a copy of its intact form by homologous recombination, immunodeficiencies can be repaired by targeted gene therapy.

Nachgestellt in Gewebekulturen: Entwicklung des blutbildenden (hämatopoietischen) Systems und der Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems während der Embryonalentwicklung der Maus

Von der Befruchtung einer Eizelle bis zur Geburt einer Maus vergehen 19 Tage. Zu bestimmten Zeitpunkten dieser Embryonalentwicklung befinden sich verschiedene, in unseren Experimenten eingesetzte Zellstadien auf dem Weg zu einem System von reifen Blutzellen, also von roten Blutkörperchen, Blutplättchen, myeloiden und lymphoiden Zellen. Am Tag 3 ½ nach Befruchtung hat sich ein Blastozyst gebildet, der 64 totipotente Zellen enthält. Diese können in Gewebekultur als kontinuierlich wachsende, so genannte embryonale Stamm-Zelllinien (ES Zelllinien) etabliert werden. Jede einzelne davon, also auch die in Gewebekultur gezüchtete expandierte Zelle, trägt nach Retransplantation in die Blastozysten und Reimplantation in die Mutter zu allen Zellentwicklungen des sich entwickelnden Embryos bei. Diese Totipotenz der ES-Zellen bildet die Basis der Experimente, in denen die Entwicklung von unterschiedlich differenzierten Zellsystemen des Körpers außerhalb des Embryos in Gewebekultur nachgestellt werden kann.

Die Arbeitsgruppe hat Systeme entwickelt, die die Differenzierung der ES Zellen in hierarchischer und zeitlicher Abfolge in der Gewebekultur nachahmen, so wie sie im Embryo erfolgen würde. Dabei ist es erstaunlich, dass der zeitliche Ablauf in der Gewebekultur, einer inneren Uhr folgend, genau dem im Embryo entspricht. So finden sich zum Beispiel bereits am 11. Tag nach Induktion erste Vorboten von Zellen, die bei Transplantation in Empfängermäuse langfristig myeloide und lymphoide Zellen des Immunsystems aufbauen.

Analysen genetisch unterschiedlicher oder genetisch veränderter Embryonalentwicklung zu Zellen des Immunsystems

Eine quantifizierbare Analyse der Entwicklung von ES Zellen zu Zellen des Immunsystems in solchen Gewebekulturen ermöglicht es, bestimmte genetische Defekte dieser Entwicklung zellulär genauer zu lokalisieren und weitere Gene zu identifizieren, die zu diesen Defekten beisteuern. Darüber hinaus können Gene gesucht werden, die eine teilweise oder komplette Reparatur erlauben. Dies trägt zu dem Verständnis bei, welche molekularen Reaktionen in welchen Zellen deren Teilungs- und Überlebensfähigkeit, ihre flexible Differenzierungsfähigkeit in die verschiedenen Formen von Blutzellen, ihre Lebensdauer und ihre Wanderungsfähigkeit in das Blut und in die Organe während der Entwicklung des Immunsystems bewirken.

Die Wahl zwischen angeboren- oder adaptiv-immunaktiv beziehungsweise zwischen T- oder B-Lymphozyten

Schwerpunkte des Interesses an den hämatopoietischen (blutbildenden) Entwicklungsentscheidungen sind die Weggabelungen, an denen Progenitorzellen zwischen einer Differenzierung zu Zellen des angeborenen Immunsystems (also myeloide Zellen) und zu Zellen des adaptiven Immunsystems (also lymphoide Zellen) auswählen, und nachfolgend die Weggabelungen, an denen zwischen der Entwicklung zu T-Lymphozyten und zu B-Lymphozyten entschieden wird. In den Experimenten werden einerseits diejenigen Gene in ES Zellen durch molekulare Marker farbig markiert, die in diesen frühen Stadien an den Entwicklungsentscheidungen beteiligt sind, andererseits werden mutierte Formen dieser Gene eingefügt, deren Anwesenheit oder Expression eine Änderung der Entwicklungsentscheidung zwischen myeloiden und lymphoiden Zellen erwarteten lässt.

Die Bildung von Blutzellen aus blutbildenden Stammzellen, die sich im Knochenmark befinden, ist ein kontinuierlicher Prozess, bei dem ein Leben lang immer neue, differenzierte Zellen gebildet werden, die nach kurzem Verweilen im Körper wieder absterben. Also besitzt das Knochenmark zumindest alle Differenzierungsstadien, von der pluripotenten Stammzelle (vergleichbar dem embryonalen Stadium am Tag 11 bis 12) bis zu den reifen Zellen (vergleichbar der Geburt der Maus am Tag 19). Es ist gelungen, langzeitig wachsende Gewebekulturlinien von pluripotenten blutbildenden Stammzellen, von Progenitoren mit myeloiden und lymphoiden Potenzen und von Vorläuferzellen der T- und/oder B-Lymphozyten zu etablieren (Abb. 1). Wenngleich diese Zellen eine homologe Rekombination von den zu untersuchenden Genen nicht erlauben, können sie doch wenigstens durch retrovirale Vektortransfektion stabil mit solchen Genen beladen und verändert werden, deren Funktionen an den wichtigen Entscheidungspunkten der hämatopoieischen Entwicklung interessant sind.

Gewebekultur: Zwei Typen von Zellen sind sichtbar - größere, die das angeborene und adaptive Immunsystem langfristig aufbauen können, und kleinere, die die Progenitoren der Lymphozyten darstellen. Aus den totipotenten Zellen eines Blastozyten gebildet, befinden sich in der Gewebekultur am 11. Tag, also zu einer der in vivo vergleichbaren Zeit im Embryo, die ersten Zellen, die nach Transplantation aus diesen Gewebekulturen in Mäusen die verschiedenen Zellkompartimente des angeborenen und des adaptiven Immunsystems, also myeloide und lymphoide Zellen, langzeitig aufbauen. Weitere zwei bis 4 Tage später, also zu einer Zeit, bei der in der fötalen Leber und dem fötalen Thymus die ersten Progenitorzellen der B- und T-Lymphozyten des adaptiven Immunsystems zu finden sind, tauchen auch in den ES Differenzierungs-Gewebekulturen die ersten Zellen mit typischen molekularen Kennzeichen ihrer prä-lymphoiden Natur auf. Innerhalb der darauf folgenden 4 Tage, also in der Zeit, die der Embryonalentwicklung kurz vor der Geburt vergleichbar ist, können die ersten präT- und präB-Zellkulturen etabliert werden, aus denen schon in früheren Versuchen durch Transplantation oder in vitro Differenzierung reife T- und B-Zellen des Immunsystems gewonnen werden konnten.

Der Nutzen von angeborenen und adaptiven Immunsystemen

Ohne ein Immunsystem sind Vertebraten, wie Mäuse und Menschen, nicht lebensfähig. Die schweren, genetisch bedingten Immundefizienzen von Kindern und die durch HIV Infektionen bewirkten schweren Defizienzen beweisen dies. Schwere Immundefizienzen werden aber auch durch Therapien wie starke Bestrahlung ausgelöst, die klinisch dann angewandt werden muss, wenn der Körper durch Krebs oder Autoimmunität in Mitleidenschaft gezogen ist. Die Transplantation von Knochenmarkszellen geeigneter Spender hilft in vielen Fällen, ein schwer schadhaftes oder geschädigtes Blut- und Immunsystem zu reparieren. Von einem besseren Verständnis der Blutbildung kann eine Verbesserung der klinischen Knochenmarkstransplantationen erhofft werden. Ein Beispiel: Eine einzige hämatopoietische Stammzelle ist in der Lage, nach Transplantation in einem mit einer tödlichen Dosis bestrahlten Rezipienten dessen Blutzellen, immerhin über 1012 Zellen beim Menschen, wieder aufzufüllen und den Organismus damit vor dem Strahlentod zu retten.

Alle Vertebraten bilden angeborene und adaptive Immunsysteme, die die Prozesse der Entzündung, der Phagozytose und der Zytotoxizität als Hauptabwehrreaktionen gegen fremde Eindringlinge wie zum Beispiel Viren, Bakterien und Parasiten, aber auch gegen fremdes, transplantiertes Gewebe benutzen. Zudem bildet das adaptive Immunsystem durch Rearrangements von speziellen Gensegmenten ein Antigen-bindendes Rezeptor-Repertoire, das auf der Oberfläche von Lymphozyten präsentiert wird: Ein Lymphozyt prägt immer nur eine bestimmte Rezeptorstruktur mit einer bestimmten Antigenspezifität aus, wobei die vielen Milliarden von Lymphozyten eine nur durch die Zahl der Zellen begrenzte Diversität von Antigen-spezifischen Lymphozyten beinhalten.

Das Immunsystem, insbesondere auch sein adaptiver Teil, kann gegen die Antigene des eigenen Körpers, gegen die es normalerweise tolerant ist, so genannte Autoantigene aktivieren und so auch autoimmune Erkrankungen auslösen.

Der kontrollierte, durch Toleranzinduktion begleitete Aufbau des angeborenen und des adaptiven Immunsystems lässt sich sehr gut mit den in Gewebekultur genetisch markierten und zu verschiedenen Stadien der Blutbildung entwickelten Zellen durch nachfolgende Transplantation in Rezipienten verfolgen und bietet so eine gute experimentelle Möglichkeit, Faktoren zu erkennen und zu studieren, die autoimmune Deregulationen des Systems bewirken.

Alle blutbildenden Zellen können, losgelöst von Zellverbänden und Organen, existieren und viele ihrer Funktionen als einzelne Zellen ausüben, besonders die der Rezeptor-induzierten intrazellulären Signalübertragungen und der Regulationen von Genexpression, Damit ist eine quantitative Analyse der Funktionen von einzelnen Genen in einzelnen Zellen und von einzelnen Zellen im System möglich. Die zeitlich und funktionell getreue Nachstellung der Entwicklung der Zellen des Blut- und Immunsystems in Gewebekulturen bildet eine wichtige experimentelle Basis für das gesuchte funktionelle Verständnis von Genen, Molekülen und Zellen des Bluts und des Immunsystems.

Originalveröffentlichungen

1.
A. G. Rolink, S. L Nutt, F. Melchers, M. Busslinger:
Long-term in vivo reconstitution of T-cell development by Pax5-deficient B-cell progenitors.
Nature 401, 603-606 (1999).
2.
F. Melchers:
The pre-B-cell receptor: selector of fitting immunoglobulin heavy chains for the B-cell repertoire.
Nature Reviews in Immunology 5, 578-584 (2005).
3.
C. Schaniel, L. Bruno, F. Melchers, A. G. Rolink:
Multiple hematopoietic cell lineages develop in vivo from transplanted Pax5-deficient pre-B I-cell clones.
Blood 99, 472-478 (2002).
4.
C. Schaniel, M. Gottar, E. Roosnek, F. Melchers, A. G. Rolink:
Extensive in vivo self-renewal, long-term reconstitution capacity, and hematopoietic multipotency of Pax5-deficient precursor B-cell clones.
Blood 99, 2760-2766 (2002).
5.
M. Tsuneto, A. Tominaga, H. Yamazaki, M. Yoshino, S. H. Orkin, S. Hayashi:
Enforced expression of PU.1 rescues osteoclastogenesis from embryonic stem cells lacking Tal-1. Stem.
Stem Cells 23, 134-143 (2005).
Zur Redakteursansicht