Forschungsbericht 2015 - Max-Planck-Institut für Kohlenforschung

Biomoleküle im Kontext ihrer molekularen Umgebung

Autoren
Heyden, Matthias
Abteilungen
Theoretische Chemie (Walter Thiel)
Zusammenfassung
Dieser Artikel behandelt Computer-Simulationen mit unterschiedlichen Modellen zur Untersuchung des Einflusses der Umgebung auf die Eigenschaften von Biomolekülen, beispielsweise Enzymen und anderen Proteinen. Es wird gezeigt, wie die Bewegungen von Proteinen und umgebenden Wassermolekülen durch gemeinsame, kollektive Schwingungen beeinflusst werden. Weiter werden die Einflüsse von Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen auf deren Stabilität beschrieben, besonders bei hohen Konzentrationen, wie sie im Zellinneren vorliegen.

Einleitung

"Everything that living things do can be understood in terms of the jiggling and wiggling of atoms." Dieses berühmte Zitat von Richard Feynman beschreibt treffend den Hintergrund von klassischen Molekulardynamik-Simulationen, die eingesetzt werden um die Bewegungen von Molekülen und Atomen im Computer nachzustellen. Moleküle werden hierbei im Wesentlichen durch Kugeln dargestellt, welche durch schwingende Federn verbunden sind. Wechselwirkungen untereinander werden durch analytische Terme beschrieben, deren Parameter im Vorfeld empirisch bestimmt wurden, sowie durch elektrostatische Kräfte, welche sich aus ungleichmäßigen Ladungsverteilungen innerhalb der Moleküle ergeben. Mit diesem einfachen Modell ist es möglich, die intra- und intermolekularen Schwingungen, das „jiggling and wiggling“ komplexer Biomoleküle, insbesondere Enzyme und anderer Proteine, in ihrer molekularen Umgebung im Computer zu simulieren und selbst die Bewegungen einzelner Atome im Detail zu analysieren. Der Vergleich zu experimentellen Daten stellt hierbei sicher, dass die Modelle die Realität mit ausreichender Genauigkeit reproduzieren.

Chemische Reaktionen können auf diesem Niveau der theoretischen Beschreibung nicht untersucht werden. Hierzu muss ein solches Modell zumindest für einen Teil des Systems die quantenmechanischen Eigenschaften der Elektronen beinhalten, wie es in sogenannten QM/MM-Simulationen der Fall ist [1]. Der hiermit verbundene Rechenaufwand beschränkt jedoch den in Simulationen beobachtbaren Zeitraum in der Regel auf einige 10 bis 100 piko-Sekunden (1 ps = 10−12 s). Rein klassische Simulationen erlauben es hingegen physikalische Prozesse (kein Bruch bzw. Bildung kovalenter chemischer Bindungen) auf Zeitskalen bis zu einigen mikro-Sekunden (1 µs = 10−6 s) zu beschreiben, beispielsweise die Änderung der dreidimensionalen Konformation eines Proteins oder auch das Binden eines Ligand-Moleküls, sowie intra- und intermolekulare Schwingungsbewegungen und Relaxationsprozesse.

Simulationen, welche detailliert die Bewegungen jedes einzelnen Atoms beschreiben, umfassen aufgrund der notwendigen Rechenzeit in der Praxis meist nur einzelne oder einige wenige Biomoleküle. Um Wechselwirkungen zwischen vielen unterschiedlichen Biomolekülen in komplexen Umgebungen simulieren zu können, wird in solchen Fällen auf einen Teil der Auflösung verzichtet. Unter anderem werden Lösungsmittelmoleküle (z. B. Wasser) nicht explizit einbezogen, sondern ihr Einfluss auf darin gelöste Moleküle und ihre Wechselwirkungen untereinander nur indirekt beschrieben.

Informationsgewinn aus Simulationen

Um biologische Prozesse gezielt beeinflussen zu können, beispielsweise durch medizinische Wirkstoffe, ist es letztendlich notwendig, die Funktionsweise von Biomolekülen im Detail zu verstehen sowie die Auswirkungen von Punkt-Mutationen in der Aminosäure-Sequenz eines Proteins oder der Anwesenheit von Liganden vorhersagen zu können. Diese Informationen ergeben sich auch durch die Möglichkeit der realistischen und detaillierten Modellierung im Computer nicht automatisch. Im Gegenteil gilt es aus den zeitabhängigen Trajektorien vieler Tausend einzelner Atome die relevanten Informationen zu gewinnen, welche zum Erkenntnisgewinn beitragen. Hierbei sind korrelierte Bewegungen von Atomen von besonderer Bedeutung, beispielsweise die konzertierte Bewegung funktioneller Einheiten eines Enzyms.

Die Analyse solcher Korrelationen und gemeinsamer Bewegungen beschränkt sich meist auf das simulierte Biomolekül selbst. Dieses ist jedoch von kondensierter, flüssiger Materie umgeben, beispielsweise einer wässrigen Lösung oder einer Lipid-Membran. Die realistische Darstellung dieser Umgebung spielt in Computer-Simulationen eine große Rolle und verschlingt in vielen Fällen tatsächlich den Großteil der eingesetzten Rechenleistung. Allerdings beginnen wir den Einfluss der Lösungsmittel-Umgebung auf in ihr stattfindende dynamische Prozesse erst allmählich zu verstehen.

Korrelierte Dynamik von Biomolekülen und ihrer Umgebung

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Abb. 1: Ausschnitt des Wasserstoffbrücken-Netzwerks in der Hydrathülle eines Proteins aus einer Molekulardynamik-Simulation.
Abb. 1: Ausschnitt des Wasserstoffbrücken-Netzwerks in der Hydrathülle eines Proteins aus einer Molekulardynamik-Simulation.

Neueste Studien in Zusammenarbeit mit dem Exzellenzcluster RESOLV (EXC−1069) konzentrieren sich speziell auf den Aspekt des Lösungsmitteleinflusses. In atomistischen Molekulardynamik-Simulationen werden hierzu die Korrelationen der Schwingungs-bewegungen von Proteinen und umgebenden Wassermolekülen analysiert. Hierbei wird gezeigt, wie sich lokale Schwingungen zwischen Proteinen und Wassermolekülen an deren Oberfläche über das dreidimensionale Netzwerk von Wasserstoffbrücken in der sogenannten Hydrathülle ausbreiten (siehe Abb. 1). Der zugrundeliegende Mechanismus kann mit der Ausbreitung von Schallwellen verglichen werden und führt zu korrelierten Protein-Wasser-Bewegungen, welche weit in die Umgebung reichen [2].

Die Ergebnisse zeigen, dass die Dynamik von Proteinen nicht als isoliert von der jeweiligen Umgebung angenommen werden kann, sondern diese in die Betrachtung mit einbezogen werden muss. Darüber hinaus deutet sich hierdurch ebenfalls die Gelegenheit an, die dynamischen Eigenschaften eines Proteins – und damit auch seine Funktion – durch Manipulation der Lösungsmittel-Umgebung zu beeinflussen. Ein qualitativer Einblick in korrelierte Protein-Wasser-Schwingungen ist in Abbildung 2 am Beispiel eines Fragments des λ-Repressor-Proteins gegeben [3]. Die Ausbreitung von korrelierten Bewegungen von Atomen des Proteins und umgebender Wassermoleküle ist hier für verschiedene Frequenzen im Terahertz-Bereich (1 THz = 1012 Hz) dargestellt, welcher charakteristisch für Schwingungsbewegungen zwischen Molekülen ist.

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Abb. 2: Korrelierte Schwingungsbewegungen von Atomen auf der Oberfläche des Proteins (schematische Darstellung in Rot und Weiß) und Wassermolekülen in der Hydrathülle bei unterschiedlichen Frequenzen im Terahertz-Bereich (1 THz = 1012 s-1). Dargestellt sind Bereiche gleichgerichteter (grün) und entgegengesetzter (blau) korrelierter Schwingungs-Bewegungen der Protein- und Wasser-Atome (siehe auch Referenz [3]).
Abb. 2: Korrelierte Schwingungsbewegungen von Atomen auf der Oberfläche des Proteins (schematische Darstellung in Rot und Weiß) und Wassermolekülen in der Hydrathülle bei unterschiedlichen Frequenzen im Terahertz-Bereich (1 THz = 1012 s-1). Dargestellt sind Bereiche gleichgerichteter (grün) und entgegengesetzter (blau) korrelierter Schwingungs-Bewegungen der Protein- und Wasser-Atome (siehe auch Referenz [3]).

Die Untersuchung korrelierter Schwingungsbewegungen von Biomolekülen und ihrer flüssigen Umgebung wird durch die Entwicklung speziell angepasster Analyse-Verfahren ermöglicht. Die Ergebnisse bestätigen die Interpretation von spektroskopischen Messdaten im Terahertz-Frequenzbereich, in denen eine Änderung der Schwingungen des Wasserstoffbrücken-Netzwerkes des Wassers in der Umgebung von Biomolekülen beobachtet wurde [4]. Die hieraus abgeleitete Reichweite der Beeinflussung intermolekularer Schwingungsbewegungen in der Hydrathülle von über 10 Å (1 Å = 10−10 m) wird durch die Analyse der Simulationen bestätigt und mechanistisch begründet.

Aus diesem Ergebnis lassen sich unter anderem Regeln für die notwendige Systemgröße bei der Simulation von Biomolekülen in wässriger Umgebung ableiten, um  die Einflüsse kollektiver Schwingungs-Bewegungen korrekt darzustellen. Darüber hinaus trägt die Entdeckung langreichweitiger kollektiver Protein-Wasser-Schwingungen entscheidend zu unserem Verständnis des Einflusses der Lösungsmittelumgebung auf dynamische Prozesse in biologischen Systemen bei. Bei der wissensbasierten Entwicklung medizinischer Wirkstoffe und der Optimierung von Enzym-Systemen für industrielle Anwendungen können diese Informationen in der nahen Zukunft eine wichtige Rolle spielen.

Auf engem Raum – Einfluss hoher Konzentrationen im Zellinneren

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Abb. 3: Grafische Darstellung eines Escherichia coli Zytoplasma-Modells mit 50 unterschiedlichen Arten von Biomolekülen und 1000 individuellen Molekülen [5] (Strukturdaten von Adrian Elcock, University of Iowa).

Abb. 3: Grafische Darstellung eines Escherichia coli Zytoplasma-Modells mit 50 unterschiedlichen Arten von Biomolekülen und 1000 individuellen Molekülen [5] (Strukturdaten von Adrian Elcock, University of Iowa).

In vielen in vitro Experimenten, als auch in den oben beschriebenen Molekulardynamik-Simulationen, werden Proteine in verdünnter, wässriger Lösung untersucht. Die natürliche Umgebung eines Proteins unterscheidet sich hiervon in der Regel jedoch drastisch, beispielsweise das Zytoplasma im Inneren einer Zelle. Der Wasseranteil liegt hier nur bei etwa 60-70% und es liegt eine äußerst hoch konzentrierte Lösung diverser Biomoleküle vor, welche miteinander wechselwirken. Dies ist zur Veranschaulichung in Abbildung 3 für ein Modell des Zytoplasmas von Escherichia coli dargestellt [5]. In einigen in vitro Experimenten wird versucht, den Einfluss der natürlichen Umgebung durch den Zusatz von Polymerpartikeln zu imitieren. Das verringerte Platzangebot aufgrund des Ausschluss-Volumens dieser Partikel kann hierbei zu einer Stabilisierung von kompakt gefalteten Proteinen führen (Volumenausschluss-Theorie). Auch die Kinetik von Proteinaggregations-Prozessen und enzymatisch katalysierten Reaktionen kann durch den Einsatz der Polymerpartikel, sogenannter „Crowding“-Agentien, beeinflusst werden. Inwieweit solche Experimente den Einfluss der natürlichen biologischen Umgebung wiedergeben, ist jedoch nicht eindeutig geklärt.

Die Arbeitsgruppe um Simon Ebbinghaus an der Ruhr-Universität Bochum untersucht den Einfluss der Umgebung auf die Stabilität von gefalteten Konformationen im Inneren von lebenden Zellen anhand experimenteller Messungen. Der mittlere End-zu-End-Abstand fluoreszenz-markierter Polyethylenglykol-Polymere definierter Länge kann mittels Förster-Resonanz-Energie-Transfer im Mikroskop bestimmt werden. Die Polymere können hierbei sowohl in verdünnter Lösung, in Anwesenheit von „Crowding“-Agentien, sowie nach der Injektion in lebende Zellen untersucht werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass im Gegensatz zu den Voraussagen der Volumenausschluss-Theorie keine signifikante Stabilisierung kompakt gefalteter Polymere im Inneren der Zelle zu beobachten ist [6].

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Abb. 4: Simulationsmodell des fluoreszenzmarkierten Polyethylenglykol-Polymers bei dominanten repulsiven Wechselwirkungen. Die angedeuteten Abstände der Fluoreszenzmarker zeigen eine Kontraktion des Polymers bei steigender Konzentration (von links nach rechts) [6].

Abb. 4: Simulationsmodell des fluoreszenzmarkierten Polyethylenglykol-Polymers bei dominanten repulsiven Wechselwirkungen. Die angedeuteten Abstände der Fluoreszenzmarker zeigen eine Kontraktion des Polymers bei steigender Konzentration (von links nach rechts) [6].

Bei der Interpretation der Experimente kommen auch Computer-Simulationen flexibler Polymere in unterschiedlichen Umgebungen zum Einsatz (Abb. 4). Diese basieren auf einem weiter vereinfachten Simulationsmodell, welches es erlaubt, derart komplexe Systeme zu beschreiben [7]. Die Ergebnisse dieser Simulationen zeigen, dass eine Stabilisierung kompakt gefalteter Polymer-Konformationen nur bei dominant repulsiven Wechselwirkungen zwischen den Molekülen realisiert wird. Unspezifische attraktive Interaktionen hingegen können dem Volumenausschluss-Effekt entgegenwirken, so dass auch bei hohen Gesamtkonzentrationen im Inneren der Zelle keine Bevorzugung kompakter Konformationen der Polymere auftritt. Die Experimente zeigten allerdings auch, dass eine Erhöhung der Biomolekülkonzentration im Zellinneren, etwa durch einen hypertonischen Schock, den Volumenausschluss-Effekt verstärkt, so dass eine kompakte Faltung der Polymerketten energetisch begünstigt wird [6].

Schlussbemerkungen

Biomoleküle sind durch die Evolution daran angepasst, in ihrer natürlichen Umgebung optimal zu funktionieren. Diese Umgebung zeichnet sich für viele Proteine sowohl durch die Anwesenheit von Wasser als auch durch hohe Konzentrationen von anderen Biomolekülen aus. Die Funktionsweise und die dynamischen Eigenschaften von Biomolekülen lassen sich nicht isoliert von ihrer Umgebung verstehen, daher ist eine detaillierte Beschreibung dieser Umgebung in Computer-Simulationen unabdingbar. Gleichzeitig liefern Simulationen Einblicke in die mikroskopischen Mechanismen, welche den Umgebungseinflüssen zugrunde liegen. Ein detailliertes Verständnis dieser Einflüsse wird es in Zukunft erlauben, die evolutionären Anpassungen von Enzymen und anderen Biomolekülen an ihre jeweilige molekulare Umgebung zu verstehen und diese Erkenntnisse in die Entwicklung von Wirkstoffen und Katalyse-Verfahren einfließen zu lassen.

Literaturhinweise

1.
Senn, H. M.; Thiel, W.
QM/MM Methods for Biomolecular Systems
Angewandte Chemie International Edition 48, 1198-1229 (2009)
2.
Heyden, M.; Tobias, D. J.
Spatial Dependence of Protein-Water Collective Hydrogen-Bond Dynamics
Physical Review Letters 111, 218101 (2013)
3.
Heyden, M.
Resolving anisotropic distributions of correlated vibrational motion in protein hydration water
Journal of Chemical Physics 141, 22D509 (2014)
4.
Ebbinghaus, S.; Kim, S. J.; Heyden, M.; Yu, X.; Heugen, U.; Gruebele, M.; Leitner, D. M.; Havenith, M.
An extended dynamical hydration shell around proteins
Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 104, 20749-20752 (2007)
5.
McGuffee, S. R.; Elcock, A. H.
Diffusion, crowding & protein stability in a dynamic molecular model of the bacterial cytoplasm
PLoS Computational Biology 6, e1000694 (2010)
6.
Gnutt, D.; Gao, M.; Brylski, O.; Heyden, M.; Ebbinghaus, S.
Excluded volume effects in the living cell
Angewandte Chemie International Edition 54, 2548-2551 (2015)
DOI: 10.1002/anie.201409847
DOI
7.
Mereghetti, P.; Gabdoulline, R. R.; Wade, R. C.
Brownian dynamics simulation of protein solutions: structural and dynamical properties
Biophysical Journal 99, 3782-3791 (2010)
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