Forschungsbericht 2008 - Max-Planck-Institut für chemische Ökologie

Genforschung auf der Ebene des Organismus: Wie man Molekularbiologen für Freilandstudien ausrüstet

Autoren
Baldwin, Ian Thomas
Abteilungen

Molekulare Ökologie (Prof. Ian T. Baldwin)
MPI für chemische Ökologie, Jena

Zusammenfassung
Der Einfluss eines Gens auf die Darwin'sche Fitness eines Organismus bestimmt darüber, ob es im Verlauf der natürlichen Selektion verloren geht, erhalten bleibt oder modifiziert wird. Allerdings verfügen Biologen bisher über nur sehr wenige gene expression systems, mit denen Genfunktionen in einem Gesamtorganismus untersucht werden können. In der Abteilung Molekulare Ökologie am MPI für chemische Ökologie werden molekulargenetisch orientierte Freilandbiologen ausgebildet: Sie erhalten die Expertise, transformierte Pflanzen, in denen die Expression von umweltbedingt regulierbaren Genen ausgeschaltet wurde, in ihrem natürlichen Lebensraum zu beobachten und auszuwerten. Diese Forschung, so hoffen die Wissenschaftler, soll es ermöglichen, den Einfluss definierter Gene auf die Darwin'sche Fitness des Organismus Pflanze besser zu verstehen.

Gen – Spezies – Umwelt

Gene können auf allen Ebenen biologischer Einheiten Funktionen ausüben: Zelle, Gewebe, Organ, Organismus, Population, Art, Gemeinschaft und Ökosystem. Ob ein Gen verloren geht, erhalten bleibt oder durch natürliche Selektion verändert wird, hängt davon ab, wie seine Expression die Darwin'sche Fitness des Organismus beeinflusst. Die Untersuchung von Genfunktionen in Gesamtorganismen mitsamt ihrem Einfluss auf die Fitness gestaltet sich jedoch relativ aufwändig, weshalb Genprodukte zunächst nur rein biochemisch charakterisiert werden. Derartig beschriebene Eigenschaften eines Genprodukts können vielleicht, müssen jedoch keineswegs auf die Funktion im Gesamtorganismus hindeuten. Hinzu kommt, dass – seit die vollständigen Genomsequenzen verschiedener Spezies zur Verfügung stehen – nicht selten die erste Hypothese bezüglich einer aufzuklärenden Genfunktion allein über Sequenz-Ähnlichkeiten zu anderen, bereits charakterisierten Genen formuliert wird. Auch wenn diese Methode sicherlich oft wertvolle Hinweise liefert: Das folgende Beispiel zeigt, wie derartige „einfache“ Hypothesen von anderen, genauso gültigen Erklärungen ablenken können.

Spezielle, in den Augen von Wirbeltieren angereicherte, wasserlösliche Proteine (Crystalline) sind in höchstem Maße Taxon-spezifisch. Ihre Sequenzen sind identisch mit gängigen Stoffwechselenzymen wie zum Beispiel Aldehyd-Dehydrogenasen oder Transketolasen [1]. Diese enzymatische Aktivität ist allerdings im Vergleich zu ihrer eigentlichen lebenswichtigen Funktion auf der organismischen Ebene wahrscheinlich sekundär, wenn nicht sogar irrelevant. Die Aufgabe der Crystalline besteht darin, eine lichtdurchlässige, strukturell unterstützende Umgebung für das Sinnes-Organ „Auge“ zu schaffen.

Diese andere, nämlich rein strukturelle Funktion von primärmetabolischen Enzymen in einem spezialisierten Organ wie dem Auge war in diesem Beispiel für den Forscher vielleicht schon bei der Probennahme unmittelbar erkennbar – in vielen anderen Fällen ist die tatsächliche Funktion jedoch sicherlich nicht derart offensichtlich. Ein tieferes Verständnis des Organismus ist erforderlich, um herauszufinden, welchen Einfluss ein Gen auf den gesamten Organismus hat. Der (experimentelle) Mangel an organismischen gene expression systems, gepaart mit der unvollständigen Kenntnis ihrer Naturgeschichte, schränkt die Fähigkeit von Biologen immer wieder ein, Genfunktionen organismisch-übergreifend zu verstehen. So kann man beispielsweise die Hefe, als das biochemisch und molekularbiologisch am besten beschriebene eukaryotische gene expression system, auf seiner gesamt-organismischen Ebene immer noch nicht begreifen. Wir wissen kaum etwas über das natürliche Leben von Hefen außerhalb des Erlenmeyerkolbens, in dem sie üblicherweise kultiviert und untersucht werden, sodass ein großer Teil des Hefegenoms funktionell uncharakterisiert bleibt – und dies nach mehr als einer Dekade seit der Verfügbarkeit der kompletten DNA-Sequenz. Diese Erkenntnis unterstreicht, dass wir in der jetzigen Ära der „-omics“-Spezialdisziplinen unsere Fähigkeit verloren haben, Biologen mit einem „Gefühl für den Organismus“ auszubilden. Das früher mehr im Mittelpunkt stehende Studium der Naturgeschichte von Organismen verlor in dem Moment an Bedeutung, als die „omics-Werkzeugkiste“ (genomic, transcriptomic, proteomic, metabolomic usw.) den Zugang zu einer neuen Sicht auf eine Handvoll genomsequenzierfähiger Organismen geöffnet hatte und dabei die „biologische Intuition“ in den Hintergrund drängte.

Integration der Fortschritte aus der Molekularbiologie in die Untersuchung ökologischer Wechselwirkungen

Aber Abhilfe wird bereits geschaffen. Biologen, die die neuesten Technologien zu nutzen wissen, haben die „omics-Werkzeuge“ so verfeinert, dass man sie fast auf jeden Organismus anwenden kann. Das rasend schnelle Tempo bei der DNA- und Protein-Sequenzierung verwischt die Grenzen zwischen „Modell-“ und „Nicht-Modell-Organismus“; Transkript-Arrays und ihre Analyse sind inzwischen kommerzielle Gebrauchsgüter geworden; Proteom- und Metabolom-Analysen sind gängige Verkaufsargumente für neue analytische Instrumentierung. Allein die Transformation, also die gezielte und dauerhafte Übertragung von Erbgut in einen Zielorganismus, bleibt bislang ein schwieriger und oft langwieriger Prozess. Aufgrund der Verfügbarkeit und universellen Anwendbarkeit dieser neuen Methoden auf die gesamte organismische Vielfalt, jenseits einiger weniger Modellorganismen, erhält die klassische „Naturgeschichte“ ihre Anerkennung zurück und das reiche Erbe organismischer Biologie gewinnt wieder an Bedeutung.

Mit den dramatisch gesunkenen Kosten für Sequenzierungen ist die dereinst schwierige Quantifizierung Darwin'scher Fitness in der Einheit „Sequenz-Ähnlichkeit“ erschwinglich geworden. Man stelle sich dazu die Darwin'sche Evolution als einen Strom von Nukleotiden vor, der in der Zeit immer weiter fließt. Organismen treiben diesen genetischen Strom voran, und die Darwin'sche Fitness des Organismus misst den Erfolg dieser Transmission. Organismen sind dabei mitnichten passive Kanäle, sondern im Gegenteil eher wie FedEx-Mitarbeiter zu verstehen, die neue Wege finden müssen, ihre genetischen Lieferungen immer erfolgreicher der nächsten Generation zu überbringen – zeitiger, verlässlicher und ökonomischer.

Ein Forschungsansatz: Abschalten von Genen mittels kleiner RNAs

Die neuen Einblicke in die Rolle kleiner RNAs bei der Regulierung der Genexpression waren Grundlage für die Erzeugung von DNA-Transformations-Konstrukten; diese Konstrukte ermöglichen es den Biologen, die Expression einzelner genetischer Elemente präzise zu beeinflussen. Dadurch ist es möglich, in Experimenten rigoros zu bestimmen, was den einen „FedEx-Mitarbeiter“ fitter macht als den anderen. Damit solche Experimente erfolgreich sind, benötigen Biologen sowohl gesamtorganismische gene expression systems als auch ein organismisches Verständnis der einzelligen Organismen, die heute für solche Studien verwendet werden. Die Forschung mit diesen gene expression systems muss alle Herausforderungen der realen Welt, mit denen ein Organismus üblicherweise konfrontiert wird, beinhalten – idealerweise sollte deshalb der natürliche Lebensraum des Organismus quasi wie ein Labor-Analogon genutzt werden.

Die Ausbildung einer Generation von Freilandbiologen mit zusätzlichen molekularen Fertigkeiten – die also in der Lage sind, sich der Werkzeuge der „omics“-Disziplinen zu bedienen und feine Veränderungen in einem Organismus wahrzunehmen – wird voraussichtlich eine größere Herausforderung sein als beispielsweise die Erfüllung aller gesetzlichen Auflagen zur Freisetzung transgener Pflanzen in Deutschland. In der Doktorandenausbildung spiegelt sich vielfach die unglückliche, strikte Aufteilung der biologischen Abteilungen in molekular-zellbiologische und ökologisch-evolutionsbiologische Zweige wider.

Das übergreifende Forschungsziel der Abteilung Molekulare Ökologie am MPI für chemische Ökologie in Jena ist die Integration von Fortschritten in der Molekularbiologie in die Untersuchung von ökologischen Wechselwirkungen; im Gegenzug können gesamtorganismische Fachkenntnisse aus der Ökologie in die „abstrakten“ Studien zur Genfunktion einfließen. Um dies zu erreichen, wird eine neue Generation von Biologen ausgebildet, deren Denken auf den Gesamtorganismus ausgerichtet ist, und dies in einer Umgebung, die ihnen Zugang zu und Unterstützung bei der Verwendung molekularer Techniken bietet. Diese Techniken ermöglichen die Analyse ökologisch bedeutsamer Merkmale sowie deren Manipulation und nachfolgende Untersuchung unter natürlichen Bedingungen.

„Frag die Pflanze“: Nature as a Laboratory

Um dies in die Tat umzusetzen, wurde ein „molekulares Toolkit“ für zwei Wildpflanzenarten (Nicotiana attenuata und Solanum nigrum) entwickelt und angefangen, diejenigen Gene zu verstehen, die für die Darwin'sche Fitness dieser Pflanzenarten in ihrem natürlichen Lebensraum, beispielsweise des Great Basin Desert in Nordamerika, verantwortlich sind. Der Forschungsschwerpunkt der Arbeitsgruppe um Ian Thomas Baldwin liegt auf der Untersuchung der Merkmale, die es der Pflanze ermöglichen, in der freien Natur trotz Schädlingsbefall zu überleben. Deshalb spielt die Feldstation der Abteilung in Utah im Südwesten der USA eine zentrale Rolle in der Forschung: Alle Forschungsprojekte beginnen mit Hypothesen, die in der Freilandarbeit ihren Ursprung haben und die mit Funktionstests während und nach der Freisetzung transformierter Pflanzen beendet werden.

Die Untersuchungen haben gezeigt, dass diese zwei Wildpflanzenarten viele dynamische Verteidigungsstrategien besitzen, um sich gegen Fraßfeinde (Herbivore) und Pathogene zu wehren – ohne dabei ihre Bestäuber oder andere Nützlinge zu schädigen – und um mit der Konkurrenz zu anderen Pflanzen (-arten) zurechtzukommen. Pflanzen verteidigen sich durch eine erhöhte Produktion von sekundären Stoffwechselprodukten, die wiederum die Leistungsfähigkeit der Herbivoren herabsetzen. Einige dieser chemischen Abwehrsubstanzen haben einen direkten Einfluss auf das Verhalten der Insekten, indem sie Nahrungsaufnahme, Wachstum und Reproduktion durch verdauungshemmende Enzyme oder die Produktion von Giften reduzieren. Andere Substanzen funktionieren als indirekte Abwehr, indem sie die natürlichen Feinde der Herbivoren zu der befallenen Pflanze locken.

Mithilfe molekularbiologischer Methoden werden die Abwehrfunktionen solcher sekundärer Stoffwechselprodukte aufgedeckt. Einfache RNAi-Konstrukte, die von konstitutiv exprimierenden Promotoren gesteuert werden, machen es möglich, die Produktion sekundärer Pflanzenstoffe via „gene-silencing“ (Gen-Ausschaltung) zu unterbinden, ohne dass gleichzeitig das Pflanzenwachstum beeinträchtigt wird. Weil sich allerdings die Heterotrophie vor der Photosynthese entwickelt hat, müssen Pflanzen immer wieder mit drohendem Kahlfraß fertig werden, sodass sie alle Aspekte ihres Stoffwechsels, nicht nur ihres Sekundärmetabolismus, ausschöpfen müssen, um sich zu wehren. Die Überprüfung der Abwehrfunktion beispielsweise von primären Stoffwechselprodukten wird eine fortgeschrittenere Technik der Gen-Ausschaltung erfordern, um deren Rolle in der Verteidigung gegen oder Toleranz von Herbivorenbefall zu entschlüsseln. Derart präzise Methoden zur Abschaltung von Genen werden es ermöglichen, Gene gewebespezifisch und zeitlich exakt zu inaktivieren. Ziel dabei ist, den Einfluss der Gen-Inaktivierung auf Wachstum und Entwicklung bei der Bestimmung der Leistungsfähigkeit und Resistenz gegen Herbivoren unter natürlichen Bedingungen zu minimieren.

Die Ausbildung der Studenten, die diese Experimente durchführen, wird dabei ebenso wichtig sein wie die Erfüllung der technischen Erfordernisse bei der Abschaltung von Genen. Bestimmte Methoden von Transkriptionsstudien bieten eine Möglichkeit, die Pflanze zu „fragen“, welche Gene als Reaktion auf Herbivorenbefall reguliert wurden. Damit hält sozusagen die Pflanze selbst überprüfbare Hypothesen darüber bereit, welche Gene für die Toleranz oder Abwehr wichtig sind. Die vielleicht schon in Datenbanken vorhandenen Annotationen der reagierenden Gene klassifizieren und spezifizieren ihre vermeintliche biochemische Funktion, die auf der Gleichartigkeit von Sequenzen beruht. Diese Annotationen sind zwar wertvoll, aber sie sollten mit Vorsicht betrachtet werden, weil sie, wie schon eingangs gesagt, andere Funktionen oder Funktionen auf anderen Ebenen des Organismus nicht ausschließen. Die Studenten werden lernen, diese Annotationen zu ignorieren, um ganz und gar unbefangen experimentelle Ansätze zu entwickeln, die den normalen Ablauf von biologischen Entdeckungs- und Erkenntnisprozessen auf den Kopf stellen (Abb. 1): Anstatt in der Charakterisierung Schritt für Schritt vom Gen über Transkript, Protein und Stoffwechselprodukt zum Gewächshaus-Phänotyp und erst dann zum Freilandversuch vorzustoßen, wird man Freilandversuche nicht nach, sondern während oder besser noch vor der Analyse von Genfunktionen durchführen müssen, um sich nicht von Annotationen in den Gen-Datenbanken irreleiten zu lassen.

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Arbeitsablauf einer unvoreingenommenen Analyse von Merkmalen, die für das Überleben und die Leistungsfähigkeit einer Pflanze in der „realen Welt“ wichtig sind.

Ein Beispiel: Die Rolle von Threonin-Deaminase bei der Signalwirkung in der pflanzlichen Verteidigung

Das Enzym Threonin-Deaminase (TD) spielt bei der Biosynthese der Aminosäure Isoleucin (Ile) eine entscheidende Rolle (Abb. 2A). Überraschend ist, dass der TD-Transkriptgehalt in insektenbefallenen Blättern im Vergleich mit nicht befallenen Blättern dramatisch ansteigt. Diese Beobachtung wurde durch umfassende Microarray-Analysen bestätigt (Abb. 2B). Bereits eine nur mechanisch hervorgerufene Verwundung erhöhte die TD-Transkriptgehalte etwas, wenn jedoch solche Verwundungsstellen mit Herbivor-spezifischen Signalmolekülen – wie zum Beispiel den typischen Fettsäure-/Aminosäure-Konjugaten aus den Mundsekreten der Larven – behandelt wurden, stiegen die TD-Transkriptgehalte enorm an. Manche Tabakpflanzen, die mit einem DNA-Fragment aus der 3’-untranslatierten Region des entsprechenden TD-Gens aus Nicotiana attenuata in antisense-Orientierung (as) transformiert worden waren, wiesen normale Wachstumsraten auf (Abb. 2C). Dies zeigt, dass deren Aminosäurestoffwechsel trotz Verringerung des TD-Transkriptgehalts nicht beeinträchtigt, die durch Herbivoren induzierte TD-Transkript-Akkumulation allerdings inaktiviert war. Wenn man Larven des auf Tabakpflanzen spezialisierten Herbivoren Manduca sexta auf die Pflanzen setzte, waren die Wachstumsraten dieser Raupen signifikant höher, verglichen mit den Raten der auf Wildtyp-Pflanzen fressenden Larven (Abb. 2D). Dieses Ergebnis war der Schlüssel für die Erkenntnis, dass ein pflanzlicher Verteidigungs-Signalweg in diesen TD-antisense-Pflanzen beeinträchtigt war. Eine detaillierte Analyse von Phytohormonen, die im Verlauf von Herbivorenattacken aktiviert werden, offenbarte, dass Threonin-Deaminase auch dasjenige Isoleucin (Ile) bereitstellt, das an der Verwundungsstelle Jasmonsäure (JA) konjugiert und so eine essenzielle Grundlage für die Synthese des Signalmetabolits JA-Ile liefert. Nachfolgend konnte gezeigt werden, dass JA-Ile eine zentrale Rolle bei der Aktivierung der Abwehrsignale nach Herbivorenbefall spielt (Abb. 2E; [2,3]). Proteomanalysen bestätigten, dass Threonin-Deaminase und auch Arginase ebenfalls eine Verteidungsfunktion nach Fraß an Tomatenpflanzen haben, indem sie die essenziellen Aminosäuren Threonin und Arginin abbauen [4].

Ähnliche Verfahren wurden verwendet, um die zentrale Rolle kleiner RNAs bei der Vermittlung von pflanzlichen Reaktionen zu erforschen [5]. Für diese Experimente wurden in transgenen N. attenuata-Pflanzen drei verschiedene RNA-abhängige RNA-Polymerasen (RdR 1-3) ausgeschaltet, und die Pflanzen wurden nachfolgend in ihrem natürlichen Lebensraum freigesetzt. Es wurde gezeigt, dass verschiedene RdRs eine Rolle im Hinblick auf die Herbivoren-Resistenz, den UV-B-Schutz und das Wachstum von Tabakpflanzen spielen [5].

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Die transgene Inaktivierung von Threonin-Deaminase führte zur Identifizierung eines neuen Abwehrsignals in Tabakpflanzen gegen Herbivorenbefall. Threonin-Deaminase (TD), deren biochemische Funktion die Synthese der essenziellen Aminosäure Isoleucin (Ile) ist (A), wird nach Insektenbefall stark hochreguliert (B). Transformierte Pflanzen, in denen der Herbivoren-induzierte Anstieg der TD-Transkript-Akkumulation ausgeschaltet wurde, waren in ihrem Wachstum nicht beeinträchtigt (C), aber hochempfindlich gegenüber Befall von Manduca sexta-Larven (D). Dies lässt vermuten, dass TD entweder als postingestiver direkter Abwehrmechanismus eine Rolle spielt, indem sie die Verfügbarkeit von Threonin im Raupendarm reduziert, oder aber dass sie für die Signalkette zur Mobilisierung der pflanzlichen Abwehr bedeutend ist (E, linkes Flussdiagramm), indem sie Isoleucin (Ile) für dessen Konjugation an Jasmonsäure liefert, um ausreichend JA-Ile zu produzieren. Wie sich herausstellte, ist beides der Fall.

Ausblick

Solange Gen-Inaktivierungen (gene silencing) zur Erforschung des Einflusses auf die Darwin'sche Fitness das Pflanzenwachstum nicht dramatisch verändern, kann schon ein einzelner Freilandversuch einem mit fundierter Kenntnis der Naturgeschichte der Pflanze ausgestatteten Forscher – der also beispielsweise die Belastungen kennt, denen eine Pflanze in ihrer natürlichen Umgebung ausgesetzt ist – die Identifizierung des ökologischen Phänotyps ermöglichen. Es ist also offensichtlich, dass wir in Zukunft sowohl durch das „Fragen“ der Pflanze als auch durch die „omics“-Werkzeugkiste noch viel zu lernen haben, um die „Antworten“ der Pflanze, die durch Befall von Fraßfeinden ausgelöst werden, in den Genen, den Proteinen und den Stoffwechselprodukten zu entschlüsseln und zu verstehen. Wenn wir es schaffen, vorausblickend genug zu denken, um die Gen-Annotationen in den DNA-Datenbanken zu ignorieren, Methoden zu entwickeln, die präzise genug sind, um Gene derart gezielt auszuschalten, dass das Pflanzenwachstum nicht allzu stark beeinflusst wird, und dann schließlich die natürliche Herbivorengemeinschaft zu „fragen“, ob die Pflanze resistenter oder toleranter gegenüber Herbivorenbefall geworden ist, dann können wir zweifellos viel Neues darüber lernen, wie Pflanzen in der „realen Welt“, nämlich in der freien Natur, überleben.

Danksagung

Angela Overmeyer, Jan-Wolfhard Kellmann und Markus Hartl sei gedankt für Übersetzung und Lektorat des Textes sowie Evelyn Claussen für die Zusammenstellung der Abbildungen.

Originalveröffentlichungen

1.
C.M. Sax, C. Salamon, W.T. Kays, J. Guo, F.S.X. Yu, R.A. Cuthbertson, J. Piatigorsky:
Transketolase is a major protein in the mouse cornea.
Journal of Biological Chemistry 271, 33568-33574 (1996).
2.
J.H. Kang, L. Wang, A. Giri, I.T. Baldwin:
Silencing threonine deaminase and JAR4 in Nicotiana attenuata impairs jasmonic acid-isoleucine-mediated defenses against Manduca sexta.
Plant Cell 18, 3303-3320 (2006).
3.
L. Wang, S. Allmann, J. Wu, I.T. Baldwin:
Comparisons of LOX3- and JAR4/6-silenced plants reveal that JA and JA-AA conjugates play different roles in herbivore resistance of Nicotiana attenuata.
Plant Physiology, DOI:10.1104/1144/pp.1107.109264 (2007).
4.
H. Chen:
Stability of plant defense proteins in the gut of insect herbivores (vol 143, pg 1954-1967, 2007).
Plant Physiology 144, 1233-1233 (2007).
5.
S.P. Pandey, I.T. Baldwin:
RNA-directed RNA polymerase 1 (RdR1) mediates the resistance of Nicotiana attenuata to herbivore attack in nature.
Plant Journal 50, 40-53 (2007).
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