Von Restriktionsenzymen zu TALENs

CRISPR/Cas9 ist nicht die erste Methode, mit der Wissenschaftler das Erbgut gezielt verändern können, sie ist aber die mit Abstand am einfachsten anzuwendende. Denn bei CRISPR/Cas9 bestimmt die Sequenz der crRNA/tracrRNA beziehungsweise einer künstlichen „guideRNA“, wo die DNA zerschnitten wird. Von RNA-Molekülen können Wissenschaftler im Labor vergleichsweise einfach unterschiedliche Sequenzvarianten herstellen. Bislang mussten dazu ganze Proteine oder Proteinteile angepasst werden – ein Vorgang, der deutlich komplizierter ist als bei den kleinen RNA-Molekülen. Im Vergleich mit allen anderen bislang verfügbaren Methoden lässt sich CRISPR/Cas9 deshalb viel leichter auf eine bestimmte Schnittstelle auf dem DNA-Strang „programmieren“.

Restriktionsenzyme

Schon vor CRISPR/Cas9 waren verschiedene Typen von Endonukleasen bekannt – also Enzymen, die DNA durchtrennen können. So begann mit der Entdeckung sogenannter Restriktionsenzyme Anfang der 1970er Jahre eine neue Ära der Molekularbiologie. Diese Enzyme erkennen charakteristische DNA-Sequenzen und zerschneiden sie. Auch mit diesen Enzymen können Bakterien und Archaeen also fremdes Erbgut in ihren Zellen ausfindig und unschädlich machen.

Wissenschaftler haben die Restriktionsenzyme unter anderem dazu eingesetzt, DNA gezielt zu zerschneiden und an den Schnittstellen neue Gene einzufügen. Allerdings lässt sich nur schwer vorherbestimmen, wo genau das Gen eingebaut wird, denn die Erkennungssequenzen der meisten Restriktionsenzyme sind nur wenige Basenpaare lang und kommen daher oft mehrfach in einem Genom vor. Außerdem ist die Spezifität eines Restriktionsenzyms von den Umgebungsbedingungen abhängig.

Wissenschaftler haben daher nach Wegen gesucht, die Genauigkeit von Restriktionsenzymen zu verbessern und sie so zu verändern, dass sie eine Sequenz erkennen, die im Erbgut einzigartig ist. Ein Beispiel dafür sind sogenannte Meganukleasen. Das Design solcher Enzyme, die längere DNA-Sequenzen erkennen, ist jedoch besonders anspruchsvoll, da ein einziger Proteinteil die für die Erkennung und das Schneiden zuständig ist.

Ein weiteres Resultat dieser Forschung sind die Zinkfingernukleasen.

Zinkfingernukleasen

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Original 1510742265
Zinkfingernukleasen bestehen aus zwei Untereinheiten mit jeweils einer DNA-Bindedomäne (Zinkfinger; orange) und einem DNA-Schneideteil (blau). Die Bindedomäne enthält mehrere Zinkfinger aus je drei Aminosäuren, die an einen drei Basen langen DNA-Abschnitt binden können. Mehrere solcher Zinkfingerabschnitte hintereinander können so eine einzigartige Sequenz im Erbgut identifizieren.
Zinkfingernukleasen bestehen aus zwei Untereinheiten mit jeweils einer DNA-Bindedomäne (Zinkfinger; orange) und einem DNA-Schneideteil (blau). Die Bindedomäne enthält mehrere Zinkfinger aus je drei Aminosäuren, die an einen drei Basen langen DNA-Abschnitt binden können. Mehrere solcher Zinkfingerabschnitte hintereinander können so eine einzigartige Sequenz im Erbgut identifizieren.

Diese künstlichen Enzyme bestehen aus einer Untereinheit, die die gewünschte DNA-Sequenz erkennen, sowie einem DNA-schneidenden Teil eines Restriktionsenzyms. In der DNA-Bindedomäne sind mehrere Zinkionen an die Aminosäurekette gebunden. Diese bildet dadurch Schleifen („Zinkfinger“), die an DNA binden können. Jeder Zinkfinger erkennt einen charakteristischen Abschnitt von drei Basenpaaren. So genügen drei hintereinander geschaltete Zinkfinger, um eine bestimmte Stelle im Erbgut mit hoher Treffsicherheit zu erkennen.

Es erfordert jedoch viel Aufwand und Fachwissen, solche Zinkfingernukleasen herzustellen und die Zinkfinger so zu verändern, dass sie an einen gewünschten DNA-Abschnitt andocken. So reicht es beispielsweise nicht, die individuelle Erkennungssequenz mehrerer Zinkfinger zu kennen und zu kombinieren, um damit an der gewünschten Stelle zu schneiden. Sie beeinflussen ihre individuellen Erkennungssequenzen nämlich gegenseitig. Obwohl es verschiedene Methoden dafür gibt, können weltweit nur wenige Forschungslabors Zinkfingernukleasen nach Maß herstellen.

TALENs

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Original 1510742265
Auch TALENs bestehen aus zwei Untereinheiten. Jede der rund 30 Aminosäuren langen TAL-Effektor-Bindedomänen (lila, grün, gelb, rot) erkennt einen Buchstaben des genetischen Codes. Welcher das ist, bestimmt eine einzelne, sehr variable Aminosäure. Viele hintereinandergeschaltete Bindedomänen erkennen auf diese Weise eine bestimmte Sequenz auf der DNA, so dass der Nuklease-Teil (blau) das Erbgut schneiden kann.
Auch TALENs bestehen aus zwei Untereinheiten. Jede der rund 30 Aminosäuren langen TAL-Effektor-Bindedomänen (lila, grün, gelb, rot) erkennt einen Buchstaben des genetischen Codes. Welcher das ist, bestimmt eine einzelne, sehr variable Aminosäure. Viele hintereinandergeschaltete Bindedomänen erkennen auf diese Weise eine bestimmte Sequenz auf der DNA, so dass der Nuklease-Teil (blau) das Erbgut schneiden kann.

Etwas einfacher in der Herstellung als Zinkfingernukleasen sind transkriptionsaktivatorartige Effektornukleasen (TALENs). Auch sie bestehen aus einer DNA-schneidenden Untereinheit eines Restriktionsenzyms und einem Teil zur Sequenzerkennung, dem sogenannten TAL-Effektor. Normalerweise dienen TAL-Effektor-Proteine Bakterien dazu, Gene in pflanzlichen und tierischen Zellen zu aktivieren, damit sie diese leichter infizieren können.

TAL-Effektoren bestehen aus bis zu 33 Wiederholungen eines meist 34 Aminosäuren langen Abschnitts. Zwei dieser Aminosäuren sind extrem variabel und bestimmen, welchen Buchstaben des genetischen Codes – also welche Base – der Abschnitt erkennt. Durch die hohe Anzahl an Wiederholungen können TAL-Effektoren somit an längere und im Genom einmalig vorkommende Sequenzen binden.

Dank der einfachen Übereinstimmung der zwei variablen Aminosäuren mit den Buchstaben des genetischen Codes können Wissenschaftler TAL-Effektoren zwar leichter für bestimmte DNA-Sequenzen entwickeln als Zinkfinger, aufwändig ist dies aber bis heute.

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