Forschungsbericht 2010 - Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik

Die Arbeitstiere der Zelle: Biomolekulare Motoren als Nanoroboter

Autoren
Diez, Stefan
Abteilungen

Diez: Molekularer Transport in der Zellbiologie und Nanotechnologie (Dr. Stefan Diez)
MPI für molekulare Zellbiologie und Genetik, Dresden

Zusammenfassung
Biomolekulare Motoren sind Mechanoenzyme, die chemische Energie in gerichtete Bewegung umsetzen. Neuerliche Fortschritte im biophysikalischen Verständnis dieser Motoren lassen ihre nanotechnologische Anwendung in greifbare Nähe rücken. So ist beispielsweise vorstellbar, Motorproteine als molekulare Roboter in synthetischer Umgebung zum Aufbau von Nanostrukturen, zur hochsensitiven Detektion von Reagenzien oder zum Sortieren molekularer Komponenten einzusetzen.

Biomolekulare Motoren sind die Arbeitstiere in unseren Zellen. Sie können die aus ATP-Hydrolyse gewonnene chemische Energie hocheffizient in mechanische Arbeit umwandeln und dabei gerichtete Bewegungsprozesse auslösen. Der wohl bekannteste Motor ist das Myosinprotein: Es bildet durch seine Bewegung entlang von Aktinfilamenten die Grundlage für die Kontraktion von Muskeln. Motorproteine sind auch in allen anderen Zellarten anzutreffen, nicht nur in spezialisierten Muskelzellen. Dort sorgen sie für den aktiven Transport intrazellulärer Komponenten, wie zum Beispiel von Mitochondrien, den Kraftwerken in einer Zelle, von neuronalen Vesikeln oder Chromosomen. Zu diesen Motoren gehören Verwandte des Muskelmyosins, die sich ebenfalls entlang von Aktinfilamenten bewegen, sowie Vertreter der Kinesin- und Dyneinfamilien, die sich entlang von Mikrotubuli bewegen (Abb. 1a).

Motoren werden für einen raschen intrazellulären Transport benötigt. Sie können Moleküle vom Ort ihres Ursprungs (typischerweise in der Nähe des Zellkerns) schnell zu ihrem Bestimmungsort (oftmals in der Zellperipherie) transportieren – Diffusion ist, vor allem auf weite Strecken, dafür oftmals zu langsam: Beispielsweise würde die passive Diffusion eines kleinen Proteins durch ein Neuron mit der Länge von einem Meter ca. 1000 Jahre in Anspruch nehmen. Kinesinmotoren hingegen haben eine Geschwindigkeit von 1-2 µm/s, sie schaffen diese Aufgabe innerhalb einer Woche. Aktinfilamente und Mikrotubuli formen im Zellinneren ein dichtes Straßennetz, auf dem sich die Motorproteine gezielt von einem Punkt zum anderen bewegen. Darüber hinaus nutzen Zellen das Zusammenspiel von Zytoskelettfilamenten und Motorproteinen: Sie bauen mit deren Hilfe hochkomplexe Strukturen auf molekularer Ebene auf. Diese Beobachtungen legen es nahe, über die Anwendung von biomolekularen Motoren als Nanoroboter – auch außerhalb der Zelle, also in künstlicher Umgebung – nachzudenken.

Biomolekulare Motoren sind ungewöhnliche Maschinen, die es vermögen, chemische Energie direkt in mechanische Arbeit umzuwandeln – also ohne den allen technischen Maschinen der Gegenwart innewohnenden Umweg über Wärme oder Elektrizität. Damit sind sie als Energiewandler hocheffizient. Die chemische Energie, die ein Kinesinmotor aus der ATP-Hydrolyse gewinnt, reicht ihm aus, um einen acht Nanometer großen Schritt gegen eine Kraft von sechs pN (Pikonewton) zu vollführen. Seine Energieeffizienz liegt damit bei ca. 50%. Für ATPase-Rotationsmotoren wurden sogar höhere Werte zwischen 80% und 100% beobachtet. Neben der hohen Energieeffizienz gibt es jedoch eine Reihe weiterer Vorteile, die biomolekulare Motoren für nanotechnologische Anwendungen attraktiv erscheinen lassen: Sie sind klein und können daher hochparallelisiert arbeiten, eine Vielzahl biochemischer Werkzeuge steht für ihre Manipulation zur Verfügung, zudem sind sie in bakteriellen Expressionssystemen kostengünstig herstellbar.

Motoren in der „manipulierten Wirklichkeit“ für Medizin und Nanotechnologie

Die experimentellen Anordnungen zum Studium von Motorproteinen außerhalb von Zellen, die so genannten In-vitro-Motilitätsassays, sind in den Abbildungen 1b-d dargestellt. Sowohl Gliding- als auch Stepping-Assays werden in wässriger Lösung, mit ähnlichen Eigenschaften wie die der Lösungen im Zellinneren, durchgeführt. Die fluoreszenzmikroskopische Beobachtung der Bewegungsvorgänge einzelner und mehrerer Motoren ermöglicht die Aufklärung der biophysikalischen Funktionsweise von Motorproteinen, auch über das reine Transportverhalten hinaus [1-5]. Da Fehlfunktionen von Kinesin-, Dynein- und Myosinmotoren zu einer Reihe von Krankheiten führen können, erlaubt das bessere Verständnis der molekularen Funktionsweise dieser Motoren die Entwicklung spezifischer Wirkstoffe zur Vermeidung der Fehlfunktionen. In diesem Sinne profitiert die medizinische Forschung bereits jetzt von der Untersuchung biomolekularer Motoren in künstlicher Umgebung.

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Original 1293749676
Kinesin-Mikrotubuli-Assays. a) In zellulärer Umgebung transportieren Kinesinmotoren entlang von Mikrotubuli-Schienen. Die Bewegung molekularer Motoren kann in vitro auf verschiedene Weise untersucht werden: b) in Gleitexperimenten (Gliding-Assays), wobei die Filamente durch Substrat-gebundene Motoren über die Oberfläche bewegt werden oder c) in Schreitexperimenten (Stepping-Assays), wobei die Filamente auf dem Substrat fixiert sind und sich die Motoren entlang der Filamente bewegen. d) Sequenz von fluoreszenzmikrokopischen Aufnahmen, die die Bewegung eines einzelnen, GFP-markierten Kinesinmotors (grün) entlang eines Mikrotubulus (rot) zeigt.
Kinesin-Mikrotubuli-Assays. a) In zellulärer Umgebung transportieren Kinesinmotoren entlang von Mikrotubuli-Schienen. Die Bewegung molekularer Motoren kann in vitro auf verschiedene Weise untersucht werden: b) in Gleitexperimenten (Gliding-Assays), wobei die Filamente durch Substrat-gebundene Motoren über die Oberfläche bewegt werden oder c) in Schreitexperimenten (Stepping-Assays), wobei die Filamente auf dem Substrat fixiert sind und sich die Motoren entlang der Filamente bewegen. d) Sequenz von fluoreszenzmikrokopischen Aufnahmen, die die Bewegung eines einzelnen, GFP-markierten Kinesinmotors (grün) entlang eines Mikrotubulus (rot) zeigt.

Für nanotechnologische Anwendungen ist die Geometrie des Gliding-Assays am vielversprechendsten, da mehrere Motoren beim Transport zusammenarbeiten und somit höhere Kräfte erzeugt werden können. In einer einfachen Anwendung könnten beispielsweise gleitende Mikrotubuli verwendet werden, um Cargo (Fracht) an einem Punkt A aufzunehmen, es entlang eines vorgegebenen Weges zu einem Punkt B zu transportieren und dort abzulegen (Abb. 2a). Um die Transportbewegung in kontrollierter Weise ablaufen zu lassen, sind sowohl räumliche Führungsstrukturen als auch zeitliche Kontrollmechanismen notwendig. Während sich topographische Strukturierungen in Kombination mit chemischen Oberflächenmodifikationen zum Führen gleitender Mikrotubulitransporter entlang vorgegebener Bahnen als effektiv erwiesen haben (Abb. 2b,c), ist die dynamische Steuerung mittels externer Kräfte möglich [6]. Da Aktinfilamente und Mikrotubuli leicht negativ geladen sind, können elektrische Gleichfelder angewandt werden, um die Bewegungsrichtung der Filamente zu beeinflussen. Gleichermaßen eignen sich dielektrophoretische Kräfte sowie Kräfte, die aus hydrodynamischen Feldern resultieren. Außerdem können die Motoren durch die Zugabe oder den Entzug von ATP oder spezifischen Inhibitoren gestartet und gestoppt werden. Ein weiterer Steuerungsmechanismus wird möglich, wenn die Motoren in eine Schicht thermisch-schaltbarer Moleküle eingebettet werden (Abb. 2d). Diese Moleküle nehmen abhängig von der Umgebungstemperatur eine kompakte (bei über 32°C) oder gestreckte (bei weniger als 32°C) Anordnung ein. Entsprechend können die Mikrotubuli bei hoher Temperatur mit den Motorproteinen interagieren oder werden bei niedriger Temperatur von der Oberfläche abgestoßen [7]. Dieser Prozess ist reversibel und kann mehrere Male wiederholt werden. Aktuelle Arbeiten versuchen, diesen Schaltmechanismus in örtlich lokalisierter Form anzuwenden (Abb. 2e).

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Original 1293750110
Kontrollierte Kinesin-Mikrotubuli-Transportsysteme. a) Mikrotubuli werden durch immobilisierte Kinesinmotoren über eine Substratoberfläche bewegt. Cargo soll von Punkt A zu Punkt B transportiert werden. b) Beispiel eines lithographisch strukturierten Siliziumchips, auf dem die Bodenflächen der 300-nm tiefen Kanäle zur gezielten Motoranbindung mit Gold beschichtet wurden. Die umgebenden Bereiche wurden zur Verringerung der Proteinanhaftung mit Polyethylenglycol funktionalisiert. c) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der gerichteten Bewegung (rote Punktlinie) eines Mikrotubulus (rot) in einem Führungskanal (grün). d) Einflussnahme auf die Mikrotubulibewegung durch schaltbare Polymere. Die Kinesinmotoren wurden in eine Schicht thermisch-schaltbarer Moleküle eingebettet. e) Vorschlag zur Einbringung schaltbarer Polymere in Führungskanäle. Durch externe Signale kann die Anordnung der Polymere beeinflusst werden. Gleitende Mikrotubuli passieren die Schaltstellen dann entweder ungehindert oder sie „entgleisen“.
Kontrollierte Kinesin-Mikrotubuli-Transportsysteme. a) Mikrotubuli werden durch immobilisierte Kinesinmotoren über eine Substratoberfläche bewegt. Cargo soll von Punkt A zu Punkt B transportiert werden. b) Beispiel eines lithographisch strukturierten Siliziumchips, auf dem die Bodenflächen der 300-nm tiefen Kanäle zur gezielten Motoranbindung mit Gold beschichtet wurden. Die umgebenden Bereiche wurden zur Verringerung der Proteinanhaftung mit Polyethylenglycol funktionalisiert. c) Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der gerichteten Bewegung (rote Punktlinie) eines Mikrotubulus (rot) in einem Führungskanal (grün). d) Einflussnahme auf die Mikrotubulibewegung durch schaltbare Polymere. Die Kinesinmotoren wurden in eine Schicht thermisch-schaltbarer Moleküle eingebettet. e) Vorschlag zur Einbringung schaltbarer Polymere in Führungskanäle. Durch externe Signale kann die Anordnung der Polymere beeinflusst werden. Gleitende Mikrotubuli passieren die Schaltstellen dann entweder ungehindert oder sie „entgleisen“.

Beispiele für nanotechnologische Anwendungen

Neben der Entwicklung der geschilderten Methoden zur Einflussnahme auf die gerichteten Transportprozesse in künstlicher Umgebung, konnten bereits eine Reihe erster nanotechnologischer Anwendungen demonstriert werden [8].

In Zusammenarbeit mit Materialwissenschaftlern der TU Dresden nutzten die Forscher der Arbeitsgruppen von Stefan Diez und Jonathon Howard am MPI-CBG biotinylierte Mikrotubuli, um einzelne, an ihren jeweiligen Enden unterschiedlich funktionalisierte Lambda-DNA-Moleküle zu transportieren und von Goldkontakten auf der Oberfläche aus zu strecken (Abb. 3), [9]. Da diese Methode mittels vieler Mikrotubuli parallelisiert werden kann, besitzt sie das Potential zum effektiven Aufbau multidimensionaler DNA-Netzwerke zwischen vorgegebenen Kontakten auf einer Substratoberfläche. Nach Metallisierung der gestreckten DNA-Moleküle, beispielsweise durch Palladium in wässriger Lösung, kann das Netzwerk dann für nanoelektronische Anwendungen eingesetzt werden.

Untersuchungen zur Ankopplung von artifiziellem Cargo an Mikrotubuli mittels Biotin-Streptavidin führten zu der Erkenntnis, dass eine hohe Dichte von Streptavidinmolekülen auf der Mikrotubulioberfläche zur signifikanten Verlangsamung der Gleitbewegung führt. In Einzelmolekülexperimenten konnten die Dresdner Forscher zeigen, dass die Streptavidinmoleküle, sowie andere angekoppelte Moleküle, Hindernisse für die Kinesinmotoren darstellen [10]. Derzeit wird daran gearbeitet, diesen Mechanismus zur hochsensitiven Detektion beliebiger Makromoleküle anzuwenden. Dazu sollen verschiedene Mikrotubulipopulationen eingesetzt werden, die sich jeweils durch ihre Fluoreszenzfarbe und durch ihre Fähigkeit unterscheiden, bestimmte Moleküle an ihre Oberfläche zu binden. Ihre Gleitgeschwindigkeit, die sich auf einfache Weise messen lässt, gibt dann Auskunft über das Vorhandensein der entsprechenden Makromoleküle in der umgebenden Lösung (Abb. 3b).

Interferenzeffekte auf spiegelnden Oberflächen führen dazu, dass die detektierte Intensität fluoreszenter Objekte stark von deren Abstand zur Oberfläche abhängt. Gleitende, fluoreszent markierte Mikrotubuli können somit als sich selbst-bewegende Nanosonden zur Erkundung von Oberflächenstrukturen eingesetzt werden. Durch das nanometergenaue Verfolgen (Tracking) der Mikrotubuli und der Zuordnung der Fluoreszenzintensität zu den Ortspunkten, lässt sich die Oberfläche mit Nanometergenauigkeit in drei Dimensionen vermessen [11].

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Original 1293749725
Beispiele erster nanotechnologischer Anwendungen des Kinesin-Mikrotubuli-Transportsystems. a) DNA-Nanoelektronik: Schemazeichnung gleitender Mikrotubuli (rot), die zum Transport und zur Streckung einzelner Lambda-DNA-Moleküle (grün) verwendet wurden (oben). Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme des Transport- und Streckvorganges (unten). b) Molekulare Detektion: Makromoleküle auf der Oberfläche von Mikrotubuli behindern die Bewegung der Motorproteine. Die daraus resultierende Verlangsamung der Gleitbewegung kann zur quantitativen und hochsensitiven Bestimmung der Makromolekül-Konzentration in der Umgebungslösung verwendet werden. c) Nanometrische Oberflächenvermessung: Mikrotubuli können als sich selbst bewegende Nanosonden zur Erkundung von Oberflächenstrukturen im Nanometerbereich eingesetzt werden (links). Ein Abbild der Oberfläche erhält man beispielsweise durch die „Maximumprojektion“ vieler fluoreszenzmikroskopischer Einzelbilder, die während der Mikrotubulibewegung aufgenommen wurden (rechts).
Beispiele erster nanotechnologischer Anwendungen des Kinesin-Mikrotubuli-Transportsystems. a) DNA-Nanoelektronik: Schemazeichnung gleitender Mikrotubuli (rot), die zum Transport und zur Streckung einzelner Lambda-DNA-Moleküle (grün) verwendet wurden (oben). Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme des Transport- und Streckvorganges (unten). b) Molekulare Detektion: Makromoleküle auf der Oberfläche von Mikrotubuli behindern die Bewegung der Motorproteine. Die daraus resultierende Verlangsamung der Gleitbewegung kann zur quantitativen und hochsensitiven Bestimmung der Makromolekül-Konzentration in der Umgebungslösung verwendet werden. c) Nanometrische Oberflächenvermessung: Mikrotubuli können als sich selbst bewegende Nanosonden zur Erkundung von Oberflächenstrukturen im Nanometerbereich eingesetzt werden (links). Ein Abbild der Oberfläche erhält man beispielsweise durch die „Maximumprojektion“ vieler fluoreszenzmikroskopischer Einzelbilder, die während der Mikrotubulibewegung aufgenommen wurden (rechts).

Ausblick

Erste Schritte zur Anwendung biomolekularer Motoren außerhalb ihrer zellulären Umgebung konnten erfolgreich unternommen werden. Dennoch sind bis zum Einsatz der Motorsysteme für nanotechnologische Anwendungen eine Reihe weiterer Fortschritte nötig. Eine vordergründige Aufgabe wird es sein, die örtliche und zeitliche Steuerbarkeit der Transportsysteme weiter zu verbessern. Hierbei sollte es – durch eine Kombination von innovativen Oberflächenmethoden und externen Feldern – möglich sein, in nicht allzu ferner Zukunft molekulare Reaktionssysteme und Sortierapparate zu realisieren. Darüber hinaus sei angemerkt, dass der hohe Ordnungsgrad von DNA, Aktinfilamenten und Mikrotubuli diese biologischen Filamente dazu prädestiniert, als Templatmaterialien für drei-dimensionale Nanostrukturen mit vielfältigen materialwissenschaftlichen Anwendungen eingesetzt zu werden. Auf längere Sicht ist die Entwicklung noch robusterer Motormoleküle notwendig. Während es nicht möglich sein wird, Protein-basierte Motoren in Luft oder Vakuum arbeiten zu lassen, könnten widerstandsfähigere Motoren aus extremophilen Bakterien gewonnen oder mittels genetischer Screens identifiziert werden. Schlussendlich wäre es attraktiv, die grundlegenden Designprinzipien biologischer Motorproteine zu nutzen, um vollständig künstliche Nanomotoren zu konzipieren.

Originalveröffentlichungen

1.
J. Helenius, G. Brouhard, Y. Kalaidzidis, S. Diez, J. Howard:
The depolymerizing kinesin MCAK uses lattice diffusion to rapidly target microtubule ends.
Nature 441, 115-119 (2006).
2.
J. Kerssemakers, J. Howard, H. Hess, S. Diez:
The distance that kinesin-1 holds its cargo from the microtubule surface measured by fluorescence interference contrast microscopy.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 15812-15817 (2006).
3.
C. Leduc, F. Ruhnow, J. Howard, S. Diez:
Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 10847-10852 (2007).
4.
G. Fink, L. Hajdo, K. J. Skowronek, C. Reuther, A. A. Kasprzak, S. Diez:
The mitotic kinesin-14 Ncd drives directional microtubule-microtubule sliding.
Nature of Cell Biology 11, 717-723 (2009).
5.
V. Varga, C. Leduc, V. Bormuth, S. Diez, J. Howard:
Kinesin-8 motors act cooperatively to mediate length-dependent microtubule depolymerization.
Cell 138, 1174-1183 (2009).
6.
M. G. van den Heuvel, C. T. Butcher, S. G. Lemay, S. Diez, C. Dekker:
Electrical docking of microtubules for kinesin-driven motility in nanostructures.
Nano Letters 5, 235-241 (2005).
7.
L. Ionov, M. Stamm, S. Diez:
Reversible switching of microtubule motility using thermoresponsive polymer surfaces.
Nano Letters 6, 1982-1987 (2006).
8.
M.G. van den Heuvel, C. Dekker:
Motor proteins at work for nanotechnology.
Science 317, 333-336 (2007).
9.
S. Diez, C. Reuther, C. Dinu, R. Seidel, M. Mertig, W. Pompe, J. Howard:
Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins.
Nano Letters 3, 1251-1254 (2003).
10.
T. Korten, S. Diez:
Setting up roadblocks for kinesin-1: mechanism for the selective speed control of cargo carrying microtubules.
Lab Chip 8, 1441-1447 (2008).
11.
J. Kerssemakers, L. Ionov, U. Queitsch, S. Luna, H. Hess, S. Diez:
3D Nanometer Tracking of Motile Microtubules on Reflective Surfaces.
Small 5, 1732-1737 (2009).
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