Forschungsbericht 2006 - Max-Planck-Forschungsstelle für Enzymologie der Proteinfaltung
DnaK-Inhibitoren bei der assistierten Proteinfaltung
DnaK inhibitors in assisted protein folding
Autoren
Schiene-Fischer, Cordelia
Abteilungen
Hitzeschockproteine als enzymatische Faltungskatalysatoren (Dr. Cordelia Schiene-Fischer), MPF für Enzymologie der Proteinfaltung, Halle/Saale
Zusammenfassung
Das Hsp70-Chaperon DnaK aus Escherichia coli unterstützt die Faltung von Proteinen, wobei die cis/trans-Isomerisierung von sekundären amidischen Peptidbindungen in entfalteten und partiell gefalteten Proteinen erfolgt. Niedermolekulare Inhibitoren dieser cis/trans-Isomerase-Aktivität von DnaK wurden entwickelt und hinsichtlich ihrer Einflüsse auf die biologische Aktivität von DnaK und ihrer antibakteriellen Effekte gegenüber Escherichia coli untersucht.
Summary
The hsp70 chaperone DnaK from Escherichia coli might assist protein folding by catalyzing the cis/trans isomerization of secondary amide peptide bonds in unfolded or partially folded proteins. Small molecule inhibitors of the cis/trans isomerase activity of DnaK were developed and tested for effects on the biological activity of DnaK as well as their antibacterial effects in Escherichia coli.
Nach der Neusynthese erlangen Eiweiße (Proteine) erst durch die Faltung die richtige Struktur, die zur Ausübung ihrer Funktion notwendig ist. Die Neusynthese und die anschließende Faltung von Proteinen sind Prozesse innerhalb der Zellen, die notwendig für deren Lebensfähigkeit sind. Diese Prozesse stellen daher attraktive Ziele für die Entwicklung antibakterieller Substanzen dar.
DnaK als Faltungshelfer
Die Faltung von Proteinen wird in der Zelle durch besondere Faltungshelfer-Enzyme, die so genannten „molekularen Chaperone“ unterstützt. Ein sehr wichtiges Chaperon im Bakterium Escherichia coli ist das DnaK. Dieses Faltungshelfer-Protein kann die Faltung von etwa 20 % der neusynthetisierten Eiweiße in E. coli unterstützen. Es besitzt neben der Fähigkeit, ATP (Adenosintriphosphat) zu spalten (ATPase-Aktivität), auch die Eigenschaft, die Isomerisierung von Peptidbindungen zu beschleunigen (APIase-Aktivität) [1]. Peptidbindungen sind relativ starre, sich wiederholende Einheiten in Proteinketten, deren richtige Positionierung wichtig für den Faltungsweg eines Proteins ist. Das Vorhandensein eines spezifischen aktiven Zentrums der APIase-Aktivität von DnaK, in welchem die Beschleunigung der Isomerisierung von Peptidbindungen stattfindet, eröffnet die Möglichkeit, nach chemischen Verbindungen zu suchen, die diese sehr wichtige Funktion von DnaK unterbinden.
Die Inhibition von DnaK
Ein Schwerpunkt der Arbeit von Cordelia Schiene-Fischer ist die Identifizierung und Charakterisierung von Inhibitoren der APIase-Aktivität von DnaK. Im Rahmen dieser Untersuchungen hat sie herausgefunden, dass mit Fettsäuren verknüpfte Benzamido-Verbindungen das APIase-Zentrum von DnaK blockieren [2]. Eine solche Blockade hat zur Folge, dass die normalerweise durch DnaK unterstützte Faltung von bestimmten Proteinen ihre aktive Form in vitro nicht mehr durch DnaK verbessert wird. Entsprechend kann in Zellen die falsche Faltung und eine Verklumpung von Eiweißen hervorgerufen werden, da DnaK die Faltung dieser Eiweiße durch die Blockade seiner Funktion nicht mehr unterstützen kann.
Antibakterielle Effekte von DnaK-Inhibitoren
Die Benzamido-Verbindung unterdrückt die Hitzetoleranz von Escherichia-coli-Zellen. Escherichia-coli-Zellen, die kein DnaK enthalten, sind sensitiv gegen starke Erhitzung. Die Bildung von DnaK von einem Plasmid nach Induktion mit der dafür spezifischen Substanz IPTG stellt die Hitzetoleranz wieder her. Die zusätzliche Gegenwart der untersuchten Benzamido-Verbindung bewirkte eine Verringerung der Thermotoleranz in Gegenwart einer geringen Menge an DnaK in der Zelle. Bei Vorhandensein größerer Mengen DnaK erfolgt die Wiederherstellung der Hitzetoleranz in Gegenwart des Benzamido-Derivates. Die verschiedenen Mengen an DnaK wurden durch Verwendung verschiedener Konzentration der Induktor-Substanz IPZG erreicht. Die hitzetoleranten Escherichia-coli-Zellen wurden nach Wachstum bei 30°C für 12 h identifiziert.
Die Benzamido-Verbindung unterdrückt die Hitzetoleranz von Escherichia-coli-Zellen. Escherichia-coli-Zellen, die kein DnaK enthalten, sind sensitiv gegen starke Erhitzung. Die Bildung von DnaK von einem Plasmid nach Induktion mit der dafür spezifischen Substanz IPTG stellt die Hitzetoleranz wieder her. Die zusätzliche Gegenwart der untersuchten Benzamido-Verbindung bewirkte eine Verringerung der Thermotoleranz in Gegenwart einer geringen Menge an DnaK in der Zelle. Bei Vorhandensein größerer Mengen DnaK erfolgt die Wiederherstellung der Hitzetoleranz in Gegenwart des Benzamido-Derivates. Die verschiedenen Mengen an DnaK wurden durch Verwendung verschiedener Konzentration der Induktor-Substanz IPZG erreicht. Die hitzetoleranten Escherichia-coli-Zellen wurden nach Wachstum bei 30°C für 12 h identifiziert.
Unsere Resultate zeigen außerdem, dass die Hemmung der APIase-Aktivität von DnaK schwerwiegende Auswirkungen auf die Überlebensfähigkeit von Escherichia-coli-Zellen unter Stresseinwirkung hat. So bewirkt die Gegenwart der untersuchten inhibitorischen Substanzen, dass Escherichia-coli-Zellen, die starker Hitze ausgesetzt waren, anschließend nicht in der Lage sind, weiterzuleben und sich zu vermehren. Entsprechend dieser Verringerung der Hitzetoleranz zeigen die Hemmstoffe eine anti-bakterielle Aktivität gegen Escherichia coli, die sich unter Hitzestress-Bedingungen bei 42°C manifestiert, während bei normalen Wachstumstemperaturen von 37°C die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinflusst wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass Faltungshelfer-Proteine neue Angriffspunkte für die Entwicklung antibiotischer Substanzen bilden.
