Forschungsbericht 2015 - Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie

Plasmodium-Infektionen: Den Parasiten vor der Malaria angreifen

Autoren
Matuschewski, Kai
Abteilungen
Parasitologie
Zusammenfassung
Malaria ist eine Armuts-bedingte Infektionskrankheit der Tropen und eine Herausforderung der medizinischen Grundlagenforschung. Ein besseres molekulares Verständnis der Mechanismen der Plasmodium-Wirts-Wechselwirkung und des komplexen Lebenszyklus ist Voraussetzung für neue, Evidenz-basierte Kontrollstrategien. Neue Erkenntnisse aus der klinisch unauffälligen Leberphase und von verwandten Parasiten in Afrotropischen Fledermäusen bieten bislang unerkannte Möglichkeiten, den Parasiten vor dem Ausbruch der Malaria aufzuhalten und dem Wirt einen entscheidenden immunologischen Vorsprung zu geben.

Malaria: Warum ist der Mensch so verwundbar?

Malaria ist immer noch die weltweit wichtigste Vektor-übertragene Infektionskrankheit und gefährdet die Hälfte unserer Weltbevölkerung. Die zyklische Vermehrung des parasitären Einzellers Plasmodium in roten Blutzellen ist die einzige Phase in dessen komplexen Lebenszyklus, die die charakteristischen Fieber- und Kälte-Schübe erzeugt und den Wirt schädigt.

Infektionen mit eukaryotischen Pathogenen unterscheiden sich grundlegend von akuten bakteriellen und viralen Erregern. Die komplexe Biologie und das genetische Repertoire der Parasiten ermöglichen sehr erfolgreiche, spezielle Anpassungen an den Wirt, der Neuinfektionen selbst nach jahrelanger Immunstimulation in der Regel nicht verhindern kann. Das Fehlen einer schützenden erworbenen Immunantwort hat auch die Entwicklung von Impfstoffen gegen Malaria verhindert. Herkömmliche und bewährte Mittel zum Schutz gegen die tödlichen Folgen einer Infektion und zum Eindämmen der Verbreitung der Malaria sind Stechmücken-Bekämpfung, Insektizid-imprägnierte Bettnetze, zuverlässige Diagnostik und Therapie mit Artemisinin- Kombinationspräparaten. Doch trotz intensiver und langjähriger Kontrollprogramme gelang es bisher nur in wenigen Regionen, die Malaria erfolgreich zurückzudrängen. Neben einer nachhaltigen Stärkung der lokalen Gesundheitsversorgung in den Tropen und Subtropen fehlen vor allem wirkungsvolle Strategien, die den Parasiten vor der potenziell tödlichen Blutphase aufhalten.

Hier kann die infektionsbiologische Grundlagenforschung wertvolle Impulse und Ansätze für klinische Studien liefern. Die Malariaforschung hat sich bislang vor allem auf die diagnostisch und klinisch relevante Blutphase des komplexen Parasiten-Lebenszyklus konzentriert. Die vorgeschaltete Leberphase ist dagegen noch weitestgehend unerforscht und stellt sich inzwischen als ideales Ziel für die Entwicklung von neuen Immunisierungs-Strategien heraus. In unserer Arbeit tragen wir zu einem besseren Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen der Plasmodium-Leberstadienentwicklung bei, leiten daraus innovative Impfstrategien ab und validieren sie in präklinischen Studien. In enger Partnerschaft mit Kollegen im Deutschen Zentrum für Infektionsforschung können wir die Translation unserer Ergebnisse aus der Grundlagenforschung in klinische Studien deutlich beschleunigen.

Experimentelle Genetik in Plasmodium

Plasmodium-Parasiten können nicht sofort nach einem Stich durch eine infizierte Anopheles Stechmücke die roten Blutzellen befallen. Typisch für Parasiten ist nämlich deren Stadienkonversion. Zu jeder Phase des Lebenszyklus werden verschiedene Stadien ausgebildet, die maßgeschneidert sind für die intrazelluläre Vermehrung, das aktive Eindringen in Wirtszellen oder die Kolonisierung eines neuen Wirts.

Bei dem infektiösen Stich werden 10 µm lange Sporozoiten in die Haut übertragen. Sporozoiten haben eine charakteristische aktive Gleitbewegung entwickelt, die auf einem spezialisierten Aktin/Myosin Motor basiert. So gelangen sie sehr rasch in die Blutzirkulation und infizieren gezielt Hepatozyten, in denen sie unbemerkt ihre Reifung für die nachfolgende Blutphase durchlaufen (Abb. 1). Anstelle der humanen Parasiten, die in dieser Phase nicht untersucht werden können, wenden wir ein Infektionsmodel mit Plasmodium berghei, das ursprünglich aus Baumnagern in Zentralafrika isoliert wurde, Anopheles stephensi, einem Malaria-Vektor auf dem indischen Subkontinent, und Mäusen an.

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Original 1508157748
Abb. 1: Entwicklung von infektiösen Plasmodium Merozoiten in einer Leberzelle. Nach einem Stechmücken-Stich gelangen Sporozoiten gezielt in eine Leberzelle, wo sie sich im engen Kontakt zum Wirtszellkern abrunden (oben links). In der Wachstumsphase wächst der intrazelluläre Parasit schnell und bildet tubu-vesikuläre Strukturen aus, die in das Wirtszell-Zytoplasma hineinreichen (oben rechts). Am Ende der Leberphase ist die gesamte Wirtszelle mit Tausenden von Merozoiten gefüllt (unten links). Die Merozoiten brechen aus der infizierten Zelle heraus und gelangen in den Blutkreislauf, wo sie Erythrozyten befallen und die charakteristischen Malaria-Fieberschübe auslösen (unten rechts). Balken: 10 µm. Blau: Zellkerne; grün: Parasiten-Zytoplasma; rot: parasitophore Vakuole.
Abb. 1: Entwicklung von infektiösen Plasmodium Merozoiten in einer Leberzelle. Nach einem Stechmücken-Stich gelangen Sporozoiten gezielt in eine Leberzelle, wo sie sich im engen Kontakt zum Wirtszellkern abrunden (oben links). In der Wachstumsphase wächst der intrazelluläre Parasit schnell und bildet tubu-vesikuläre Strukturen aus, die in das Wirtszell-Zytoplasma hineinreichen (oben rechts). Am Ende der Leberphase ist die gesamte Wirtszelle mit Tausenden von Merozoiten gefüllt (unten links). Die Merozoiten brechen aus der infizierten Zelle heraus und gelangen in den Blutkreislauf, wo sie Erythrozyten befallen und die charakteristischen Malaria-Fieberschübe auslösen (unten rechts). Balken: 10 µm. Blau: Zellkerne; grün: Parasiten-Zytoplasma; rot: parasitophore Vakuole.

Mithilfe der reversen Genetik können Parasiten in der Blutphase genetisch verändert und dann im gesamten Lebenszyklus untersucht werden. Neu entwickelte Selektionstechniken erlauben uns, den Aufwand zur Gewinnung rekombinanter Parasiten zu minimieren und mehr Zeit für die Funktionsanalyse zu verwenden [1]. Der gezielte Austausch von Promotoren ermöglicht auch die Analyse von essenziellen Genen im Laufe des Plasmodium-Lebenszyklus [2]. Die experimentell genetischen Studien gewähren ein tieferes molekulares Verständnis des Entwicklungsprogramms eines parasitischen Einzellers und werfen neue Perspektiven in der Zellbiologie auf. Die Analyse eines kleinen Hitzeschockproteins, HSP20, erbrachte beispielsweise den genetischen Beweis für eine wichtige Funktion in der Migration eukaryontischer Zellen, die bislang nur durch biochemische Daten aus anderen Modellsystemen belegt war [3]. Studien zur Funktion des actin capping protein Dimers, einem essenziellen Co-Faktor für ein dynamisches Aktin-Zytoskelett, zeigten, dass beide Untereinheiten unabhängige und Stadien-spezifische Funktionen übernehmen können. Die besondere morphologische Diversität mit alternierenden intrazellulären Wachstumsphasen und beweglichen extrazellulären Stadien und die Möglichkeit, das Genom systematisch zu verändern, positioniert Plasmodium einmal mehr als ungewöhnlichen, einzelligen Modellorganismus.

Genetisch attenuierte Plasmodium Parasiten

Frühere Studien hatten gezeigt, dass ein maßgeschneidertes Ausschalten von Genen, die für die Entwicklung in der Leber essenziell sind, alle klinischen Symptome einer Plasmodium-Infektion verhindert. Außerdem wirken diese Mutanten als experimentelles lebend-attenuiertes Vakzin und lösen einen langanhaltenden Schutz gegen neue Infektionen aus [4].

Anders als in Vakzinen gegen virale oder bakterielle Pathogene, die vor allem Antikörper-vermittelte Immunantworten induzieren, sind CD8+ T-Zellen der wichtigste Bestandteil des Schutzes durch genetisch attenuierte Parasiten (GAPs; [5]). Um einen Immunschutz messbar zu machen und Vorhersagen mit Hilfe von Blutwerten treffen zu können, haben wir eine genomweite Analyse von CD8+ Epitopen durchgeführt [6]. Bioinformatische Vorhersagen möglicher Epitope, die von infizierten Zellen auf dem major histocompatibility cluster I (MHC I) präsentiert werden könnten, wurden als Polypeptide synthetisiert und auf Erkennung in immunisierten Tieren getestet. Zwei Befunde dieser Studie waren unerwartet: Lediglich zwei Epitope, die beide von Sporozoiten-Antigenen stammen, konnten gefunden werden. Diese Immunodominanz unterscheidet sich auffallend von der breitgefächerten Erkennung von Antigenen in viralen Infektionen. Zum Zweiten konnte eine gezielte Immunisierung gegen das Haupt-Antigen keinen Immunschutz auslösen. Dieses Beispiel illustriert eindrücklich, dass eine Vakzinierung gegen komplexe eukaryontische Pathogene besonders schwierig ist und womöglich nur durch attenuierte Lebendimpfstoffe gelingt.

Die Generierung und Prüfung neuer GAPs, die in verschiedenen Phasen der Leberstadien-Entwicklung arretiert sind, ist eine wesentliche Grundlage für die Evidenz-basierte Herstellung von Impfstämmen gegen humane Parasiten, beispielsweise Plasmodium falciparum. Durch das gezielte Ausschalten eines Proteins in dem Apicoplasten, einem Parasitenorganell, das Ähnlichkeiten zu pflanzlichen Chloroplasten aufweist, konnten wir eine spät arretierte Parasiten-Linie generieren. In den präklinischen Impfstudien mit diesen Parasiten wurde jedoch ein Dilemma sichtbar: Ein Anhalten gegen Ende der Parasitenreifung löst zwar einen besonders starken Immunschutz aus, jedoch ist dieser Schutz nicht sicher, da in der Immunisierungsphase immer wieder Parasiten in die Blutphase gelangen und damit eine Malaria verursachen. Lösungsansätze, die nun im Labor verfolgt werden, sind kombinatorische Gendeletionen und die systematische Suche nach besonders sicheren Parasitenlinien.

Abschwächung der Plasmodium Leberstadien durch Antibiotika

Die experimentell genetischen Befunde, dass ein gezieltes Ausschalten des Apicoplasten die vollständige Parasitenreifung verhindert, eröffnete einen alternativen experimentellen Impfansatz, der sich zudem wesentlich rascher im Menschen verwirklichen lässt: Eine Infektion mit Sporozoiten unter gleichzeitiger Gabe von kausal-prophylaktischen Antibiotika führt zu einem vergleichbaren Ergebnis, nämlich zu einer umfassenden, klinisch unauffälligen Entwicklung in der Leber, ohne dass es zu der nachfolgenden Blutphase kommt [7]. Ein Schutz gegen Neuinfektionen kann so bereits nach der zweiten Immunisierung erlangt werden. Die Verwendung von Clindamycin und Azithromycin, Antibiotika, die für Kinder und Schwangere zugelassen sind, ermöglicht perspektivisch auch eine Anwendung für die Bevölkerungsgruppen, die von der Malaria am stärksten betroffen sind. Vergleichende Studien im Mausmodell belegten, dass dieser Ansatz den besten Immunschutz im Vergleich zu anderen Lebendimpfstoffen bietet.

Der Vorteil scheint in einem verspäteten Effekt der Antibiotika auf die Leberstadien zu liegen (Abb. 2). Obwohl der Apicoplast gleich zu Beginn der Entwicklung geschädigt wird, teilt sich der Parasit zunächst weiter und wächst. Das überraschende Fehlen der üblichen Zellzyklus-Kontrolle führt dann aber möglicherweise zu einer besonders breitgefächerten Präsentation von Parasiten-Antigenen und damit zu einem immunologischen Vorteil für den Wirt.

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Abb. 2: Inhibition der Leberstadien-Reifung durch Antibiotika. Die Immunfluoreszenz-Abbildungen zeigen die normale Parasiten-Expansion mit verzweigtem Apicoplasten (links). In Anwesenheit von Azithromycin vermehrt sich der Parasit und reift, kann aber nicht den Apicoplasten in Tochterzellen verteilen (rechts). In einem „natürlichen“ Impfansatz induzieren wiederholte Gaben von Sporozoiten unter Azithromycin-Gabe einen anhaltenden sterilen Schutz gegen Neuinfektionen. Blau: Zellkerne; rot: Apicoplast.
Abb. 2: Inhibition der Leberstadien-Reifung durch Antibiotika. Die Immunfluoreszenz-Abbildungen zeigen die normale Parasiten-Expansion mit verzweigtem Apicoplasten (links). In Anwesenheit von Azithromycin vermehrt sich der Parasit und reift, kann aber nicht den Apicoplasten in Tochterzellen verteilen (rechts). In einem „natürlichen“ Impfansatz induzieren wiederholte Gaben von Sporozoiten unter Azithromycin-Gabe einen anhaltenden sterilen Schutz gegen Neuinfektionen. Blau: Zellkerne; rot: Apicoplast.

Der Ansatz aus dem Malaria-Mausmodell wird bereits in klinischen Studien mit Freiwilligen getestet, in der Hoffnung, dass sich die Ergebnisse aus der Grundlagenforschung auf die Malaria beim Menschen übertragen lassen. Im Erfolgsfall könnte dieser Ansatz auch in größerem Maßstab in Malaria-Endemiegebieten getestet werden. Ein wesentlicher Vorteil wäre, dass die natürliche Übertragung vor Ort ein wesentlicher Bestandteil der Impfstrategie ist und damit die weltweite Diversität der Plasmodium Parasiten unmittelbar erfasst wird.

Zellbiologie der Plasmodium Entwicklung in der Leber

Die Erfolge in präklinischen Immunisierungsmodellen begründen unser Interesse, die biologischen Prinzipien des Entwicklungsprogramms von Plasmodium besser zu verstehen. In unseren Arbeiten zur Funktion von Schlüsselproteinen der Sporozoiten-Übertragung und Leberentwicklung stoßen wir immer wieder auf überraschende Befunde. Beispielsweise stellte sich heraus, dass ein Inhibitor von einer Klasse von Proteasen nicht, wie bislang angenommen, beim Übergang von der Leber- in die Blutphase, sondern bereits viel früher im Lebenszyklus, nämlich bei der Kolonisierung der Speicheldrüsen der Überträgermücke, eine wichtige Rolle spielt. Sporozoiten sind offensichtlich bestens ausgerüstet für die anstehende Reise zur Leber und regulieren ihre Genexpression auf der Ebene der Translation, die ein besonders schnelles Reagieren auf die neue Umgebung, zunächst in der Haut und dann im Blutkreislauf, erlaubt.

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Abb. 3: Schematische Darstellung des tubu-vesikulären Netzwerkes von Plasmodium-Leberstadien. Während der Reifung bildet der Parasit dynamische tubuläre Strukturen und Vesikel aus, die in die Leberzelle hineinragen. Auf diesen Strukturen konnten sowohl Proteine des Parasiten (UIS4 und IBIS1) als auch der Wirtszelle (LAMP1, CD36, und LC3) nachgewiesen werden.
Abb. 3: Schematische Darstellung des tubu-vesikulären Netzwerkes von Plasmodium-Leberstadien. Während der Reifung bildet der Parasit dynamische tubuläre Strukturen und Vesikel aus, die in die Leberzelle hineinragen. Auf diesen Strukturen konnten sowohl Proteine des Parasiten (UIS4 und IBIS1) als auch der Wirtszelle (LAMP1, CD36, und LC3) nachgewiesen werden.

Sobald sich die Parasiten in einem Hepatozyten ausdifferenzieren, bilden sie ein dynamisches tubu-vesikuläres Organell aus, das weit in die Wirtszelle hineinragt [8]. Diese Struktur ist entscheidend für die Kommunikation mit der befallenen Zelle, und ihre Zusammensetzung ist erst unvollständig verstanden (Abb. 3). Auffällig ist, dass anders als in der Blutphase keine Proteine direkt in das Zytoplasma der Wirtszelle exportiert werden. Diese Beobachtung konnten wir durch die Expression eines gut charakterisierten Antigens experimentell bestätigen. Ein solcher Schutzmechanismus erschwert die Erkennung infizierter Zellen wesentlich und könnte ein wichtiger Schlüssel für die Entwicklung verbesserter Impfstrategien sein.

Von Fledermäusen lernen

Auf der Suche nach natürlich vorkommenden Parasiten/Wirtssystemen, deren Studium neue Einblicke in schützende Immunantworten gegen Malaria-Parasiten ermöglicht, haben wir uns auf afrikanische Fledermäuse und Flughunde konzentriert. Deren außergewöhnliches Immunsystem fällt immer wieder im Zusammenhang mit hochpathogenen Viren auf und spiegelt sich in ihrer ungewöhnlich langen Lebenszeit und geringen Nachkommenschaft mit langen Tragzeiten wider. Zunächst wurden Bestandsaufnahmen ihrer Malaria verwandten Parasiten in entlegenen Urwaldregionen Westafrikas gemacht [9]. Dabei haben wir eine außergewöhnliche Diversität mitsamt vier Taxa und deren Verwandtschaft untereinander phylogenetisch beschreiben können. Diese Parasiten vermehren sich fast alle ausschließlich in der Leberphase und lassen die krankmachende Blutphase aus, womöglich als evolutionäre Antwort auf die Immunkompetenz der Fledermäuse (Abb. 4). In einer kleinen Fledermausart, Hipposideros cyclops (Cyclops Rundblattnase) konnten wir eine so enge Verwandtschaft der Plasmodium-Parasiten zu unserem Nagetier-Erreger Plasmodium berghei nachweisen, dass eine Herkunft dieser Art aus Fledermäusen sehr plausibel erscheint.

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Abb. 4: Zwerg-Epauletten-Flughunde (Micropteropus pusillus) sind häufig mit Hepatocystis-Parasiten (kleines Bild), einem engen Verwandten von Plasmodium, infiziert. Im peripheren Blut sind ausschließlich sexuelle Stadien, die auf den Vektor übertragen werden, nachweisbar. Die Vermehrung der Parasiten ist auf die Leberphase beschränkt, was vielleicht eine evolutionäre Adaptation an das ausgeprägte Immunsystem der Flughunde darstellt.
Abb. 4: Zwerg-Epauletten-Flughunde (Micropteropus pusillus) sind häufig mit Hepatocystis-Parasiten (kleines Bild), einem engen Verwandten von Plasmodium, infiziert. Im peripheren Blut sind ausschließlich sexuelle Stadien, die auf den Vektor übertragen werden, nachweisbar. Die Vermehrung der Parasiten ist auf die Leberphase beschränkt, was vielleicht eine evolutionäre Adaptation an das ausgeprägte Immunsystem der Flughunde darstellt.

Um diese Infektionen längerfristig studieren und sie eventuell an Laborsysteme adaptieren zu können, haben wir eine Zusammenarbeit in Sierra Leone mit Kollegen im Gola Regenwald-Nationalpark und dem Regionalkrankenhaus in Kenema aufgebaut. In einer ersten Querschnitts-Untersuchung in drei Habitaten haben wir bereits wichtige Erkenntnisse zu der Verbreitung von Plasmodium und ihrer nicht-pathogenen Verwandten erzielen können. Die Studien, die auch die enorme Biodiversität dieses Regenwalds belegen, werden minimal invasiv durchgeführt und zeigten in einigen Fällen eine Infektionsrate von 100%. Ähnlich hohe Prävalenzen werden auch bei Menschenaffen beobachtet und von einigen Kollegen als Merkmal einer ausgeglichenen Populationsdynamik, also keineswegs als besorgniserregende Krankheitszeichen, bewertet. So lieferte beispielsweise die erste systematische Untersuchung von Nycteria-Parasiten, die sich ebenfalls ohne pathogene Blutphase entwickeln, Hinweise darauf, dass die Abfolge der Parasiten-Expansion in der Leber und die Ausbildung von sexuellen Stadien im Blut eine erfolgreiche evolutionäre Alternative zur Virulenz von Plasmodium Parasiten ist [10].

In allen untersuchten Infektionen gab es, in Analogie zur Malaria beim Menschen, wenige Anhaltspunkte für eine natürlich erworbene Immunität gegen die Leberstadien. Herausforderung und Chance für eine erfolgreiche Impfstoffentwicklung ist es, diese immunologische „Stille“ zu unterbrechen und ein anhaltendes T-Zell-Gedächtnis gegen die Leberstadien aufzubauen, um dem Wirt einen deutlichen immunologischen Vorsprung vor dem Parasiten zu geben - einen Vorsprung, der nämlich unter natürlichen Bedingungen bedauerlicherweise nicht ausgebildet wird.

Literaturhinweise

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Kenthirapalan, S.; Waters, A. P.; Matuschewski, K.; Kooij, T. W. A.
Flow cytometry-assisted rapid isolation of recombinant Plasmodium berghei parasites exemplified by functional analysis of aquaglyceroporin
International Journal of Parasitology 42, 1185-1192 (2012)
2.
Siden-Kiamos, I.; Ganter, M.; Kunze, A.; Hliscs, M.; Steinbüchel, M.; Mendoza, J.; Sinden, R. E.; Louis, C.; Matuschewski, K.
Stage-specific depletion of myosin A supports an essential role in motility of malarial ookinetes
Cellular Microbiology 13, 1996-2006 (2011)
3.
Montagna, G. N.; Buscaglia, C. A.; Münter, S.; Goosmann, C.; Frischknecht, F.; Brinkmann, V.; Matuschewski, K.
Critical role for heat shock protein 20 (HSP20) in migration of malarial sporozoites
Journal of Biological Chemistry 287, 2410-2422 (2012)
4.
Mueller, A. K.; Labaied, M.; Kappe, S. H. I.; Matuschewski, K.
Genetically modified Plasmodium parasites as a protective experimental malaria vaccine
Nature 433, 164-167 (2005)
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Hafalla, J. C.; Silvie, O.; Matuschewski, K.
Cell biology and immunology of malaria
Immunological Reviews 240, 297-316 (2011)
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Hafalla, J. C. R.; Bauza, K.; Friesen, J.; Gonzalez-Aseguinolaza, G.; Hill, A. V. S.; Matuschewski, K.
Identification of targets of CD8+ T cell responses to malaria liver stages by genome-wide epitope profiling
PLoS Pathogens 9: e1003303 (2013)
7.
Friesen, J.; Silvie, O.; Putrianti, E. D.; Hafalla, J. C. R.; Matuschewski, K.; Borrmann, S.
Natural immunization against malaria: causal prophylaxis with antibiotics
Science Translational Medicine 2: 40ra49 (2010)
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Grützke, J.; Rindte, K.; Goosmann, C.; Silvie., O.; Rauch, C.; Heuer, D.; Lehmann, M. J.; Mueller, A.-K.; Brinkmann, V.; Matuschewski, K.; Ingmundson, A.
The spatiotemporal dynamics and membranous features of the Plasmodium liver stage tubovesicular network
Traffic 15, 362-382 (2014)
9.
Schaer, J.; Perkins, S. L.; Decher, J.; Leendertz, F.; Fahr, J.; Weber, N.; Matuschewski, K.
High diversity of West African bat malaria parasites and a tight link with rodent Plasmodium taxa
Proceedings of the National Academy of Sciences USA 110, 17415-17419 (2013)
10.
Schaer, J.; Reeder, D. M.; Vodzak, M. E.; Olival, K. J.; Weber, N.; Mayer, F.; Matuschewski, K.; Perkins, S. L.
Nycteria parasites of Afrotropical insectivorous bats
International Journal of Parasitology 45, 375-384 (2015)
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