Forschungsbericht 2015 - Max-Planck-Institut für Kohlenforschung

Maßgeschneiderte Enzyme durch Mutationen im Computer

Autoren
Sanchez-Garcia, Elsa
Abteilungen
Theoretische Chemie (Walter Thiel)
Zusammenfassung
Enzyme sind hochaktive Biokatalysatoren, die untrennbar mit der Entwicklung des Lebens verbunden sind. Ein wichtiges Ziel der Forschung ist es, Enzymaktivitäten gezielt zu verändern, um neue therapeutisch wertvolle Stoffe zu synthetisieren. Voraussetzung für erfolgreiche enzymologische Experimente ist ein molekulares Verständnis des Wirkmechanismus von Enzymen. Dieser Beitrag zeigt, wie Computersimulationen bei der Voraussage von Mutationen helfen, die in einem großen Multienzym-Komplex zu einer gezielten Änderung der Selektivität führen.

Einleitung

Enzyme sind Katalysatoren in biologischen Systemen. Obwohl es auch RNA mit katalytischer Aktivität gibt, sind doch die meisten bekannten Enzyme Proteine. Die eigentliche Enzymkatalyse findet in dem aktiven Zentrum statt, wo Substrate spezifisch und mit genau definierter Orientierung so gebunden werden, dass die Bedingungen für eine chemische Reaktion optimal sind. Wichtigste Eigenschaften von Enzymen als Biokatalysatoren sind Effizienz und Selektivität.

Eine besondere Rolle in der Biokatalyse spielen intermolekulare Wechselwirkungen, deren molekulares Verständnis der Schlüssel zur Planung erfolgreicher Experimente in der Enzymologie ist. In der biomedizinischen Forschung findet man viele Beispiele dafür, wie das Verständnis der molekularen Wechselwirkungen zur Entwicklung neuer Wirkstoffe führt. Eines der wichtigsten Ziele der Pharmaforschung ist die Entwicklung schneller und effizienter Verfahren für die Synthese neuer Antibiotika.

Eine wichtige Strategie ist hierbei die Computersimulation von Enzymeigenschaften. Dazu werden verlässliche Computermodelle benötigt, mit deren Hilfe Enzyme mit maßgeschneiderten Eigenschaften konstruiert werden können. Diese Computermodelle sind die Voraussetzung für das rationale Design von Biokatalysatoren, die gezielt neue Wirkstoffe liefern. Für die experimentellen Arbeitsgruppen ist die Computersimulation eine Alternative zu zeitraubenden, teuren und häufig wenig erfolgreichen „trial and error“ Experimenten. Umgekehrt ist der Input von experimentellen Ergebnissen notwendig, um die in silico Computermodelle zu validieren.

Molekulardynamik-Simulationen (MD) bilden zusammen mit multi-scale Quantenmechanik/Molekularmechanik-Methoden (QM/MM) wichtige Werkzeuge für theoretische Studien an Enzymen. Wie aus dem Namen ersichtlich ist, beschreiben Molekulardynamik-Simulationen das zeitabhängige Verhalten molekularer Systeme. Um die Energie der Systeme zu berechnen, werden häufig klassische Molekülmechanik-Rechnungen eingesetzt, die das Mittel der Wahl für große biologische Systeme sind.

Auf der anderen Seite stehen Quantenmechanik/Molekularmechanik-Methoden (QM/MM), bei denen eine Zentralregion (z. B. die Bindungstasche eines Enzyms) mit akkuraten QM-Methoden beschrieben wird, und der größere, vom Reaktionsgeschehen aber weiter entfernte Rest des Moleküls und das Lösungsmittel, in dem die Reaktion stattfindet, mit MM-Methoden. Daher ist die QM/MM-Kombination auf ideale Weise dazu geeignet, komplexe chemische Systeme und Biomoleküle mit hoher Genauigkeit zu beschreiben [1]. ChemShell ist das modulare Programmpaket, das wir für unsere Studien nutzen, weil es erlaubt, sehr flexibel eine große Zahl an QM- und MM-Methoden miteinander zu verbinden [2].

Polyketidsynthasen

Polyketidsynthasen (PKS) sind Multienzym-Komplexe, die in Bakterien, Pilzen und Pflanzen gefunden werden und für die Synthese einer Vielzahl an biologisch wirksamen Polyketiden verantwortlich sind. Die Aktivitäten dieser Metabolite reichen von extrem toxisch (wie beim Maitotoxin) bis zu pharmazeutisch nützlich als Antibiotikum, Immunsuppressivum, cholesterin-senkendes Arzneimittel oder Krebstherapeutikum, um nur einige zu nennen (Abb. 1).

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Original 1508157603
Abb. 1: Strukturvielfalt von Metaboliten mit Polyketid-Struktur. Die PKS, die für die Biosynthese der Antibiotika Erythromycin und Monesin verantwortlich sind, wurden von uns untersucht [3, 4].
Abb. 1: Strukturvielfalt von Metaboliten mit Polyketid-Struktur. Die PKS, die für die Biosynthese der Antibiotika Erythromycin und Monesin verantwortlich sind, wurden von uns untersucht [3, 4].

In cis-Acyltransferase Typ 1 Polyketidsynthasen finden Claisen-Kondensationen zwischen Enzym-gebundenen Acylthioestern und Malonsäurebausteinen statt. An diesen Reaktionen sind Ketosynthasen (KS), Acyltransferasen (AT) und Acyl Carrier Protein (ACP) Domänen beteiligt. Optionale reduktive Folgeschritte werden über Ketoreductase (KR), Dehydratase (DH) und Enolreduktase (ER) Domänen katalysiert. Trotz ihrer enormen strukturellen Vielfalt liegt allen Polyketiden diese gemeinsame biochemische Syntheselogik zugrunde.

Um neue Polyketide biosynthetisch herstellen zu können, müssen generelle Strategien zur Diversifizierung der Bausteine in PKS entwickelt werden. Die Auswahl von Malonsäure-Bausteinen durch die PKS ist ein komplexer Prozess, der hauptsächlich durch AT-Domänen kontrolliert wird. Die Spezifität für bestimmte Bausteine kann durch Verpflanzung von AT-Domänen zwischen verschiedenen PKS geändert werden. Allerdings hat eine Verpflanzung häufig die Bildung nicht funktionsfähiger Hybrid-Enzyme zur Folge. Eine potentiell erfolgversprechendere Vorgehensweise ist die direkte Änderung von AT-Domänen durch gezielten Ersatz einzelner Aminosäuren an Stelle der ganzen Domänen. Allerdings wird diese Aufgabe durch die enorme Komplexität der PKS und mangelndes Wissen über die Bindungsstellen der Malonylthioester-Bausteine erschwert. Die gezielte Mutagenese von AT-Domänen ist eine große Herausforderung, und die Suche nach der besten Strategie für das Design der Verlängerungseinheiten noch lange nicht abgeschlossen.

Ein wichtiger Enzymkomplex für die Biosynthese des Antibiotikums Erythromycin ist die 6-Deoxyerythronolide B Synthase (DEBS). In dieser PKS akzeptieren alle AT-Domänen ausschließlich Methylmalonyl-CoA (MMCoA) als Substrat und zeigen eine hohe Sequenzhomologie. Die Herausforderung liegt nun darin, DEBS so zu variieren, dass Derivate der natürlichen Produkte mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften gebildet werden. Dieser Aufgabe steht insbesondere der Mangel an verlässlicher Strukturinformation der PKS entgegen. Das ambitionierte Ziel der Computersimulation besteht also darin, verlässliche molekulare Modelle der PKS aufzubauen. Diese Modelle sollen Voraussagen über die gezielte Mutation der AT-Domänen in PKS erlauben, damit diese künstlichen Bausteine akzeptieren, was zur Biosynthese nicht-natürlicher Derivate mit verbesserten Eigenschaften führen sollte.

Computersimulationen an DEBS

Wegen ihrer hohen Komplexität ist die chemische Modifizierung von Naturstoffen häufig eine große Herausforderung. Wie oben beschrieben, sind die AT-Domänen maßgebend für die Spezifität von DEBS verantwortlich, und daher sind die AT-Domänen das primäre Ziel für Mutagenese-Studien zur Enzymselektivität. Für die Untersuchung von DEBS wurde die letzte Acyltransferase-Domäne AT6 (AT6DEBS) ausgewählt.

Um den Einfluss von Mutationen auf die Enzymaktivität zu studieren, wurde daher AT6DEBS und seine Wechselwirkungen mit (2S)-Methylmalonyl-CoA (MMCoA) modelliert. Ein Homologie-Modell von AT6DEBS wurde auf der Basis der großen Sequenzhomologie mit den AT3- und AT5-Domänen in DEBS, für die Kristallstrukturen vorlagen, aufgebaut. Dieses AT6DEBS-Modell wurde als Ausgangspunkt für Dockingstudien mit dem Substrat MMCoA eingesetzt. Im nächsten Schritt wurden Modelle des Wildtyp-Proteins mit und ohne Substrat in einer Box mit explizitem Wasser solvatisiert und mit MD-Simulationen optimiert (Abb. 2). Mehrere MD-Simulationen wurden durchgeführt (jeweils mit Simulationszeiten zwischen 30 und 60 ns), um unterschiedliche Orientierungen des Liganden und Konformationen der Bindungstasche zu berücksichtigen. Schließlich wurden zufällig ausgewählte MD-Snapshots mit QM/MM optimiert, wobei das Substrat auf DFT-Niveau berechnet wurde [3].

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Abb. 2: Modellierte Struktur von AT6DEBS mit einer Solvathülle von Wassermolekülen.

Abb. 2: Modellierte Struktur von AT6DEBS mit einer Solvathülle von Wassermolekülen.

Nachdem auf diesem Weg ein brauchbares Modell für die Insertion von MMCoA in die aktive Tasche des Wildtyp AT6DEBS erhalten wurde, konnten die Wechselwirkung von MMCoA mit ausgewählten Mutanten untersucht werden. Als Mutanten wurden Q198R, Q198K, Y297H, S299Y, S299F und S299V ausgewählt, da für diese experimentelle Daten über deren Enzymaktivität vorhanden waren. Die Wechselwirkungen zwischen AT6DEBS und synthetischen, nicht-natürlichen Substraten wurden ebenfalls untersucht [5].

Die Qualität der Computersimulationen konnte durch Vergleich der Wildtyp-Modelle mit experimentellen Daten von DEBS überprüft werden. Ein wichtiges Teilergebnis dieser Studien war, dass die Rolle von His300 zur Aktivierung von Ser197 für die nukleophile Addition, die zur Bindung des Malonylthioesters an das Enzym führt, korrekt beschrieben wurde. Die Modelle von AT6DEBS und seinen Mutanten zeigen auch im Detail, wie die YASH-Sequenz der AT-Domäne die Selektivität kontrolliert. Für die Positionierung des Substrats sind insbesondere Gln128, Arg222, Tyr297 und Ser299 verantwortlich. Dies ist in Übereinstimmung mit experimentellen Ergebnissen, die zeigen, dass Mutationen des Arg222 für die Enzymfunktion schädlich sind. Ein wichtiges Ergebnis dieser Computersimulationen war, dass Met235 und Val295 die Spezifität der Bindungstasche stark beeinflussen, und daher bevorzugte Ziele der Mutationsstudien sein sollten. Eine Methylgruppe von Val295 befindet sich in Nachbarschaft zu der Isopropylgruppe in MMCoA und schränkt damit den freien Raum für größere Substituenten ein. Auf der anderen Seite kann der Einbau kleinerer Substituenten zu einem Verlust der Wechselwirkungen führen, die für die Substratpositionierung und ‑selektivität entscheidend sind.

Das wichtigste Ziel der Studie war die Entwicklung einer AT6DEBS-Variante, die ein propargyliertes Derivat von MMCoA als Substrat toleriert. Daher wurden Simulationen von AT6DEBS mit Propargylmalonyl-SNAC als Substrat durchgeführt. Malonyl-SNAC (MSNAC) verhält sich ähnlich wie Malonyl-CoA (MCoA) und wird daher in PKS-Studien eingesetzt. Diese Modelle bestätigten die Rolle von Met235 und Val295 und führten zum Design neuer Mutanten. Die Simulationen zeigten, dass insbesondere für starre Substituenten wie die Propargylgruppe die Orientierung sehr wichtig ist. Die Dreifachbindung in Propargylmalonyl-SNAC ist nicht flexibel genug, um in die Bindungstasche von Wildtyp AT6DEBS zu passen. Das führt zu einer Fehlpositionierung von Arg222, das aus der Bindungstasche herauswandert, und von Met235 und Val295, die nicht mehr mit den Substituenten in der Malonylregion des Substrats wechselwirken [3].

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Original 1508157604

Abb. 3: Wie durch die Computersimulation vorausgesagt, ist in der V295A-Mutation die Spezifität für die Biosynthese von Erythromycin-Derivaten reduziert.

Abb. 3: Wie durch die Computersimulation vorausgesagt, ist in der V295A-Mutation die Spezifität für die Biosynthese von Erythromycin-Derivaten reduziert.

Die Mutante V295A wurde dann modelliert, in der die Selektivität der AT-Domäne reduziert ist und Substrate mit funktionellen Gruppen, die größer als eine Methylgruppe sind, eingebaut werden können [5]. Dieses Modell wurde durch mehrere MD-Simulationen mit nicht-natürlichen Substraten ansteigender Größe getestet. Die Simulationen zeigten, dass die Bindungstasche des neuen Mutanten flexibel ist, und Substituenten mit einer Länge von bis zu drei Kohlenstoffatomen akzeptiert werden, was sowohl Allyl- als auch Propargylgruppen einschließt (Abb. 3). Im Unterschied zu dem Wildtyp ist die Bindungstasche in der V295A-Mutation flexibler und erlaubt damit die korrekte Positionierung von Propargylmalonyl-SNAC. Noch längere und sperrigere Seitengruppen werden allerdings nicht mehr toleriert. Interessanterweise wurde aber Phenylmalonyl-SNAC eingebaut. Allerdings ist es unwahrscheinlich, dass dieses die Bindungstasche auch erreichen könnte, da der Eingangskanal sehr eng ist.

Diese theoretischen Ergebnisse sind in hervorragender Übereinstimmung mit experimentellen Studien der Gruppe von Frank Schulz an der Ruhr-Universität Bochum (Abbildung 4). Tatsächlich akzeptiert die Mutante (2S)-Ethylmalonyl-SNAC, (2S)-Allylmalonyl-SNAC und (2S)-Propargylmalonyl-SNAC als Substrate und produziert damit 2-Ethyl-erythromycin, 2-Allyl-erythromycin bzw. 2-Propargyl-erythromycin. Das Phenylderivat erwies sich als zu toxisch für S. erythraea um damit Studien durchführen zu können. In schöner Übereinstimmung mit der theoretischen Vorhersage werden die Isopropyl- und Hexylderivate nicht produziert. Sowohl Theorie als auch Experiment bestätigen, dass die Substratspezifität des V295A-AT6DEBS-Mutanten reduziert ist und sich damit neue Derivate des Erythromycins synthetisieren lassen.

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Original 1508157604
Abb. 4: Die theoretischen Ergebnisse sind in hervorragender Übereinstimmung mit experimentellen Studien der Gruppe von Frank Schulz an der Ruhr-Universität Bochum.
Abb. 4: Die theoretischen Ergebnisse sind in hervorragender Übereinstimmung mit experimentellen Studien der Gruppe von Frank Schulz an der Ruhr-Universität Bochum.

Zusammenfassung

Polyketidsynthasen sind Multienzym-Komplexe von hoher medizinischer Bedeutung, da sie die Biosynthese von Antibiotika, Antikrebsmitteln und anderen biologisch aktiven Molekülen steuern. Durch „in silico“ Mutagenese-Studien an PKS ist es gelungen, Mutanten zu entwickeln, die auch nicht-natürliche Bausteine für die Biosynthese tolerieren.

Durch MD-Simulationen und QM/MM-Rechnungen wurde ein tiefer Einblick in die Wechselwirkungsmechanismen erhalten, die für den Einbau von Substraten in PKS verantwortlich sind. Dabei wurden zwei funktionelle Gruppen identifiziert, denen eine Schlüsselfunktion für die Substratspezifität der PKS zukommt. Die Met-Gruppe spielt bei der Kontrolle der Stereochemie der eingehenden Malonylderivate eine Rolle. Die sperrigere Val-Gruppe ist dagegen für die Größenselektion des eingehenden Substrats verantwortlich.

Die AT6DEBS-Variante V295A wurde konstruiert, um synthetisches Propargyl-MSNAC in den Biosynthesepfad einzuschleusen, was sowohl theoretisch als auch experimentell überprüft und bestätigt wurde. Allerdings wurde das propargylierte Erythromycin nur als Nebenprodukt erhalten, in Übereinstimmung mit den theoretischen Modellen, die für rigide Substrate wie das Propargyl-MSNAC eine genaue Ausrichtung in der Bindungstasche verlangen. Um dies zu erreichen und die Produktausbeute zu erhöhen, sind weitere Modifizierungen notwendig.

Die theoretischen Studien mit Propargyl-MSNAC zeigen auch, dass das Substrat optimiert werden kann. Obwohl MSNAC dem MCoA sehr ähnlich ist, fehlen dem kleineren synthetischen Substrat einige wichtige Bindungsmotive, insbesondere Wechselwirkungen über die Phosphatgruppen. Die Modelle zeigen, dass die Phosphatgruppen am Eingang des aktiven Zentrums mit positiv geladenen Seitenketten wechselwirken. Diese Wechselwirkungen tragen dazu bei, dass das Substrat in der Nähe zum nukleophilen Ser gehalten wird. Daher ist es sinnvoll, größere Substrate mit Phosphatgruppen zu synthetisieren und zu testen.

Die theoretischen Studien belegen eindringlich, dass die in silico Mutagenese ein unverzichtbares Werkzeug für die Entwicklung neuer Biokatalysatoren ist. Die hier vorgestellten Arbeiten erklären nicht nur den Einfluss von Punktmutationen auf die Enzymaktivität, sondern erlauben auch vorherzusagen, welche einzelne Mutation zum Einbau nicht-nativer Bausteine führt. Die durch theoretische Voraussagen geleiteten Experimente führten zum ersten Mal zur Biosynthese neuer Derivate des Erythromycins.

Literaturhinweise

1.
Senn, H. M.; Thiel, W.
QM/MM methods for biomolecular systems
Angewandte Chemie International Edition 48, 1198-1229 (2009)
2.
Metz, S.; Kastner, J.; Sokol, A. A.; Keal, T. W.; Sherwood, P.
ChemShell - A modular software package for QM/MM simulations
WIREs Computational Molecular Science 4, 101-110 (2014)
3.
Sundermann, U.; Bravo-Rodriguez, K.; Klopries, S.; Kushnir, S.; Gomez, H.; Sanchez-Garcia, E.; Schulz, F.
Enzyme-Directed Mutasynthesis: A Combined Experimental and Theoretical Approach to Substrate Recognition of a Polyketide Synthase
ACS Chemical Biology 8, 443-450 (2013)
4.
Ismail-Ali, A. F.; Klopries, S.; Kushnir, S.; Ismail, S.; Fansa, E. K.; Wittinghofer, A.; Schulz, F.; Sanchez-Garcia, E.
Predicted Incorporation of Non-Native Substrates by a Polyketide Synthase Yields Bioactive Natural Product Derivatives
ChemBioChem 15, 1991-1997(2014)
5.
Bravo-Rodriguez, K.; Klopries, S.; Koopmans, K.; Sundermann, U.; Yahiaoui, S.; Arens, J.; Schulz, F.; Sanchez-Garcia, E.
Substrate Flexibility of a Mutated Acyltransferase Domain: Implications for Polyketide Biosynthesis
Chemistry & Biology, accepted (2015)
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