Forschungsbericht 2015 - Max Planck Florida Institute for Neuroscience

Molekulare Mechanismen synaptischer Funktion

Autoren
Young, Samuel M., Jr.
Abteilungen
Research Group Molecular Mechanisms of Synaptic Function
Zusammenfassung
Für Synapsen ist es wichtig, kontinuierlich Vesikel auszuschütten, um eine korrekte Informationsverarbeitung in Nervenzellnetzen zu ermöglichen. Da aber in jeder Synapse nur ein begrenzter Vorrat an fusionskompetenten Vesikeln zur Verfügung steht, muss deren Freisetzung und Produktion ausgeglichen sein, um eine durchgängige Informationsübertragung zu sichern, vor allem im auditiven Gehirnstamm mit seinen schnellen und umfangreichen Änderungen der Feuerrate von Nervenzellen. Deshalb ist es wichtig, diese Regulationsmechanismen aufzuklären, um Lautlokalisierung und Kodierung zu verstehen.

Einleitung

Chemische Botenstoffe, Neurotransmitter genannt, sind dafür verantwortlich, dass an den Synapsen Information von Nervenzelle zu Nervenzelle übertragen werden kann. Synapsen besitzen ein präsynaptisches und ein postsynaptisches Kompartiment. Neurotransmitter werden in präsynaptischen Vesikeln (SV) gespeichert und nach Stimulierung der Nervenzelle an den synaptischen Endungen innerhalb spezieller, sogenannten aktiven Zonen freigesetzt. Nachfolgend diffundieren die Neurotransmitter durch den synaptischen Spalt und binden an Rezeptoren auf der postsynaptischen Zellmembran. Diese Form der chemischen Reizweiterleitung macht die Vesikel unabdingbar für die Informationsvermittlung zwischen Nervenzellen. Somit ist es von grundlegender Bedeutung, die Mechanismen der Regulation der Vesikel Synthese und Freisetzung zu verstehen.

In den Gehirnregionen, die für die auditive Informationsverarbeitung zuständig sind, gibt es ein außergewöhnlich großes, präsynaptisches Terminal, das „Kalyx von Held“ genannt wird. Die Kalyx von Held formt mit den Zellen des medialen Nukleus des Trapezoidkörpers (MNTB) eine gigantische axo-somatische Synapse (Abb. 1). Der MNTB transportiert neuronale Aktivitätsmuster aus der Kalyx zu anderen Zellgruppen, die am Ende für die Verarbeitung von Audiosignalen zuständig sind. Wegen der besonderen Größe und des leichten Zugangs zur betreffenden Gehirnregion präsentiert die Kalyx willkommene Möglichkeiten, die präsynaptischen Mechanismen in den frühen Phasen der Verarbeitung von auditiven Signalen zu untersuchen und zu verstehen.

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Abb. 1: Der Auditory Gehirnstamm. Globular bushy cells (GBC) innervieren den medialen Nukleus des Trapezoidkörpers (MNTB) über sogenannte „Kalyx von Held“ Terminale. Superior Olivary Complex (SOC): Nucleus Olivaris Superior = Kern der oberen Olive; SBC: Spherical Bushy Cell = runde "Bushy Cell"; GBC: Globular Bushy Cells = globuläre “Bushy Cells”; MSO: Medial Superior Olive = mittlere obere Olive; LSO: Lateral Superior Olive = seitliche obere Olive; aVCN: Anterior Ventral Cochlear Nucleus = vorderer ventraler Schneckenkern. Weitere Erläuterungen im Text.

Besonders für die Kodierung von Schallsignalen ist es zwingend notwendig, dass synaptische Verbindungen im unteren auditiven Gehirnstamm eine konstante Freisetzungsrate von SVs aufrechterhalten können. Weil aber deren Anzahl in jedem präsynaptischen Terminal begrenzt ist, stellt die auditive Signalverarbeitung besonders hohe Anforderungen an die zeitliche Koordination der SV Freisetzung und deren Recycling. Frühere Studien haben ergeben, dass es eben diese Regulierung der Bereitstellung und des Recyclings in den aktiven Zonen ist, die den Umfang der Feuerraten von Nervenzellen limitiert und damit dafür verantwortlich ist, inwieweit Synapsen noch zuverlässig Information übertragen können. Leider wissen wir aber nur sehr wenig über die molekularen Mechanismen, die die effiziente Freisetzung und Wiederbereitstellung der SVs regulieren. Das Verständnis dieser Regulationsmechanismen im unteren Gehirnstamm ist aber notwendig, damit man sich ein genaues Bild von der Kodierung der Herkunft und Intensität von Schallwellen in einem binauralen, das heißt des räumlichen Hörens befähigten Systems machen kann.

Aus diesem Grund erforschen die Neurobiologen die stimulierenden Synapsen der Kalyx von Held sowohl mit elektrophysiologischen und biophysikalischen Methoden also auch durch mikroskopische Beobachtungen von Kalziumströmen. Dazu kommen virale Vektoren und transgene Mäuse, um Interaktionen zwischen Schlüsselproteinen in der Kalyx zu manipulieren und deren Einfluss auf die Regulation von SV Freisetzung und Wiederauffüllung zu beobachten. Analysiert und ausgewertet wird, wie die Kodierung von Lauten bei Änderungen der Feuerrate über den gesamten dynamischen Bereich von Amplitude und zeitlicher Modulation vonstattengeht.

Plattformtechnologien für molekulare Studien an der Kalyx von Held

Das Ausschalten (knock-out) von Genen, die bei der synaptischen Signalübertragung eine Rolle spielen, resultiert fast immer in embryonaler oder früher, nachgeburtlicher Sterblichkeit. Da aber die Kalyx nach der Geburt und insbesondere nach Ausbildung eines funktionalen Hörsystems analysiert werden soll und darüber hinaus sich diese Struktur auch nicht in in-vitro Zellkulturen am Leben erhalten lässt, werden transgene Mäuse eingesetzt, bei denen die relevanten Gene nur zu einem bestimmten Zeitpunkt ausgeschaltet werden können. Dies ermöglicht einen gezielten und spezifischen Funktionsausfall, in dessen Verlauf geringfügig veränderte Proteine auf spezifische Interaktionen mit anderen Proteinen relevanter Signalkaskaden untersucht werden können. Zu diesem Zweck hat das Labor spezielle virale Vektoren entwickelt, die eine solche Manipulation in der Kalyx von Held ermöglichen [2, 3, 4]. Verwendet wird die sogenannte helferabhängige Adenovirale Vektor Technologie, die es erlaubt, bis zu 37 Kilobasen an fremder DNA in einem einzigen Vektor zu verpacken.

Die geschickte Kombination solcher Vektoren mit transgener Maustechnologie sowie die Etablierung weiterer moderner Technologien im Labor hat die Forschergruppe in eine einzigartige Position gebracht, die präsynaptischen molekularen Mechanismen in den frühen Phasen der Lautverarbeitung zu studieren.

Die Dynamik der synaptischen Vesikel in der Kalyx ist unabdingbar für die Kodierung von Lauten

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Abb. 2: Lebenszyklus von synapischen Vesikeln (SVs) und der Regulation ihres Auftretens durch Munc13 Proteine. 1.) Freisetzung aus dem Recycling Pool (RP) und Transport in die RRP Zone (RRP: readily releasable pool), 2.) Andocken an die aktive Zone, 3.) Priming (Vorbereitung): SVs werden zuerst fusionskompetent gemacht (Molecular priming) und dann in der Nähe von Ca2+ Kanälen positioniert (Positional priming). Dieser Prozess verläuft in zwei Phasen; nur fusionskompetente SVs können in die RRP Zone aufgenommen werden und erst nach positionellem Priming ist die Freisetzung der SVs in den synaptischen Spalt möglich. 4.) Fusion: der Prozess der Fusion mit der präsynaptischen Plasmamembran und der Freisetzung der Neurotransmitter. 5.) Endozytose: Rückbildung der Vesikelmembran und Ausbildung neuer SVs, die dann wieder den RP und RRP auffüllen können. 6.) SV Zurückführung (SV Recovery): Wiederaufnahme in den RP und RPP. Die für die SV Zurückführung verantwortlichen Mechanismen sind unterschiedlicher molekularer Natur: Ca2+ abhängige Zurückführung (Calcium Dependent Recovery) ist die Summe dieser Schritte (Docking, Priming, Recycling), die die Rate der Bereitstellung von SVs in den RP und RRP bestimmen, allerdings ist allein nur das Positional priming der geschwindigkeitslimitierende Schritt.

Wie kann die Kalyx durchgängig hohe Raten an synaptischer Informationsübertragung aufrecht erhalten? Da, wie schon gesagt, der Präsynapse nur ein beschränkter Vorrat an fusionskompetenten SVs - der sogenannte Readily Releasable Pool oder RRP, zu Deutsch: das schnell freisetzbare Reservoir - zur Verfügung steht, muss die Freisetzung und das Wiederauffüllen dieses Vorrats genau gesteuert werden. Einer der Hauptwege dieser Regulation, genannt Priming (Vorbereitung), ist die Bereitstellung von fusionskompetenten SVs in der synaptischen aktiven Zone, die dann als Antwort auf Aktionspotentiale oder neuronale Impulse sofort ausgeschüttet werden können.

Dieses Priming erfolgt über einen zweistufigen Prozess: 1) Molekulares Priming, also der Prozess, die SVs fusionskompetent zu machen, und 2) Positionelles Priming, also der Prozess, die SVs mit spannungsabhängigen Kalzium Kanälen zu koppeln. Nur Vesikel, die korrekt vorbereitet sind, können als Folge eines Aktionspotentials freigesetzt werden. Aus diesem Grund ist das Positional Priming der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, der die Verfügbarkeit von SVs reguliert (Abb. 2).

Interessanterweise haben die Wissenschaftler gefunden, dass die Distanz zwischen SV und den Kalziumkanälen der dominante Faktor ist, der die Freisetzungskinetik der RRP bestimmt (4). Die Forscher zeigten, dass 16 bis 19 Tage nach der Geburt der RRP aus zwei verschiedenen Reservoirs von SVs besteht: 1) ein schnelles Reservoir von Vesikeln, die sich in weniger als 25 nm Distanz von dem Voltage Gated Channel Cluster (VGCC) befinden, und ein langsameres Reservoir von Vesikeln, die zwischen 25 und 100 nm vom VGCC entfernt sind. Ob sich aber langsame und schnelle Vesikel in verschiedenen oder derselben aktiven Zone befinden, konnte durch die elektrophysiologische Analyse nicht geklärt werden (Abb. 3).

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Abb. 3: Unterscheidung von schnell und langsam freigesetzten synaptischen Vesikeln (SVs). Anhand der Freisetzungsgeschwindigkeit kann man die Position der SVs bestimmen. Zwei verschiedene Modelle versuchen, die elektrophysiologischen Daten zu erklären. A Langsame und schnelle Vesikel sind in derselben aktiven Zone (AZ). B Es gibt verschiedene aktive Zonen mit entweder nur schnellen oder nur langsamen Vesikel.

Die Vesikel des langsameren Reservoirs werden aber anscheinend nicht direkt als Antwort auf ein Aktionspotential ausgeschüttet. Man nimmt daher an, dass diese Vesikel nur dazu dienen, den RRP schnell wieder aufzufüllen und auf diese Weise die Synapse einen hohen Durchsatz an Aktionspotentialen auch über längere Zeiträume verarbeiten kann.

Regulierung der Vesikel-Dynamik im Gehörsystem

Kürzlich wurden neue Daten vorgelegt, die bestätigen, dass besonders diejenigen präsynaptischen Moleküle ideale Kandidaten für die Regulierung der SV Verfügbarkeit darstellen, die auch an der Organisation von synaptischen Aktionspotentialen sowie für die SV Bereitstellung notwendigen Proteine beteiligt sind. Es stellte sich heraus, dass Munc13 Proteine, die schon als Regulatoren der Priming Prozesse bekannt waren, auch an der Regulation von Kurzzeit synaptischer Plastizität beteiligt sind. Diese Form von Plastizität beschreibt ein Phänomen, bei dem sich die Effizienz der Synapse mit der Zeit und abhängig von vorheriger präsynaptischer Aktivität verändert [5]. Die Munc13 Proteinfamilie hat mehrere Mitglieder, die alle an der Regulation des molekularen Primings mittels ihrer MUN Domäne und durch Interaktionen mit SNARE Proteinen - einer umfangreichen Proteinfamilie, die bei Vesikelfusionen eine entscheidende Rolle spielt - beteiligt sind.

Die Forscher konnten nachweisen, dass in der aktiven Zone der Kalyx drei verschiedene Isoformen der Munc13 Proteine existieren, die aber unterschiedlich verteilt sind. Munc13-1, 13-2 und 13-3 sind in der aktiven Zone der Kalyx unterschiedlich verteilt, und nur Munc13-1 ist sehr nahe an der aktiven Zone lokalisiert.

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Abb. 4: Rolle der verschiedenen Munc13 Isoformen für die Regulation der RRP Dynamik (vgl. Abb. 2).Munc13-2 und Munc13-3 befinden sich in der Ca2+ microdomain, Munc13-1 hingegen agiert noch näher an den Clustern der Ca2+ Kanälen, in der sogenannten Ca2+ nanodomain. AP: Aktionspotenzial; SNARE complexes: siehe Text.

Erstmals wurde nun beschrieben, dass Munc13-1 am Positional priming beteiligt ist und eine wichtige Rolle in der Kalzium abhängigen Wiederaufname der Vesikel in den RRP spielt. Da die MUN Domäne der verschiedenen Munc13 Isoformen aber fast identisch und auch verantwortlich für das Molecular priming ist [4], geht man jetzt davon aus, dass Munc13-1 eine entscheidende Rolle in der unmittelbaren Vorbereitung der Vesikelfusion spielt (Abb. 4).

Weitere, insbesondere hochauflösende mikroskopische Untersuchungen werden die Rolle und das Zusammenspiel der Munc13 Proteine untereinander und ihre Interaktion mit den molekularen Mechanismen der Aufrechterhaltung des für das Hören notwendigen steady-state levels an SVs an der Präsynapse aufklären helfen.

Literaturhinweise

1.
von Gersdorf, H.; Borst, J. G. G.
Short-term plasticity at the calyx of held
Nature Reviews Neuroscience 3, 53-64 (2002)
10.1038/nrn705
DOI
2.
Montesinos, M. S.; Chen, Z.; Young, S. M., Jr.
pUNISHER: a high-level expression cassette for use with recombinant viral vectors for rapid and long term in vivo neuronal expression in the CNS.
Journal of Neurophysiology 106, 3230-3244 (2011)
DOI: 10.1152/jn.00713.2011
DOI
3.
Chen, Z.; Cooper, B.; Kalla, S.; Varoqueaux, F.; Young, S. M., Jr.
The Munc13 proteins differentially regulate readily releasable pool rynamics and calcium-dependent recovery at a central synapse
The Journal of Neuroscience 33, 8336-8351 (2013)
DOI:10.1523/JNEUROSCI.5128-12.2013
DOI
4.
Tong, H.; Kopp-Scheinpflug, C.; Pilati, N.; Robinson, S. W.; Sinclair, J. L.; Steinert, J. R.; Barnes-Davies, M.; Allfree, R.; Grubb, B. D.; Young, S. M., Jr.; Forsythe, I. D.
Protection from noise-induced hearing loss by Kv2.2 potassium currents in the central medial olivocochlear system
The Journal of Neuroscience 33, 9113-9121 (2013)
DOI: 10.1523/JNEUROSCI.5043-12.2013
DOI
5.
Chen, Z.; Das, B.; Nakamura, Y.; DiGregorio, D.; Young, S. M., Jr.
Ca2+ channel to synaptic vesicle distance accounts for the readily releasable pool kinetics at a functionally mature auditory synapse
The Journal of Neuroscience 35, 2083-2100 (2015)
DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2753-14.2015
DOI
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