Forschungsbericht 2003 - Max-Planck-Institut für chemische Energiekonversion

Photosynthetische Wasseroxidation

Autoren
Messinger, Johannes
Abteilungen

Biophysikalische Chemie (Prof. Dr. Wolfgang Lubitz)
MPI für bioanorganische Chemie, Mülheim an der Ruhr

Zusammenfassung
Die Ausnutzung der Sonnenenergie zur Oxidation von Wasser in Protonen, chemisch gebundene Elektronen und molekularen Sauerstoff ist eine der bedeutendsten Reaktionen für das Ökosystem Erde. Zugleich ist die photosynthetische Wasseroxidation ein Modell für die künftige technische Sonnenenergienutzung zur effizienten Spaltung von Wasser in Wasserstoff und Sauerstoff. In diesem Beitrag wird der gegenwärtige Kenntnisstand allgemein verständlich dargestellt. Ferner wird anhand von einigen Beispielen erläutert, wie am MPI für Bioanorganische Chemie diese faszinierende Reaktion mit biophysikalischen Methoden erforscht wird.

Das Ökosystem Erde konnte sich nur Dank der ‚Erfindung’ der biologischen Sonnenenergienutzung so reich und vielfältig entwickeln, wie wir es heute kennen. Hierbei ist die sauerstoffbildende (oxygene) Photosynthese von besonderer Bedeutung. In diesem komplizierten, aber hoch effizienten biologischen Prozess wird die Energie des Sonnenlichts dafür genutzt, das auf der Erde vielfältig vorhandene Kohlendioxid und Wasser in energiereiche Kohlenhydrate (Zucker) umzuwandeln.
In diesem Prozess entsteht molekularer Sauerstoff (O2), welcher vor etwa 2-3 Milliarden Jahren zunächst für viele Mikroorganismen tödlich war. Langfristig war die sauerstoffreiche Atmosphäre aber die entscheidende Grundlage für die Entwicklung höheren Lebens auf der Erde. Dies liegt zum einen an der etwa 10-mal größeren Energieausbeute beim ‚Verbrennen’ der Kohlenhydrate mit Sauerstoff (Atmung) im Vergleich zu sauerstofffreien Abbauwegen (Fermentation), und zum anderen an der Ausbildung der vor UV-Strahlen schützenden Ozonschicht (O3).
Sollte es gelingen, die photosynthetische Wasseroxidation auf molekularer Ebene zu verstehen, könnte diese Erfindung der Natur darüber hinaus zur Lösung der Energieprobleme der Welt beitragen. Man darf hoffen, dass unsere Grundlagenforschung auch der Entwicklung künstlicher Systeme zur Spaltung von Wasser in molekularen Sauerstoff und Wasserstoff entscheidende Impulse verleiht.
Cyanobakterien, Rot-, Braun- und Grünalgen, sowie Höhere Pflanzen sind zur oxygenen Photosynthese fähig. Sie alle haben zwei in Serie geschaltete, mit Lichtenergie leicht verschiedener Wellenlänge betriebene Ladungsgeneratoren, die als Photosystem 1 und Photosystem 2 bezeichnet werden (Abb. 1). Wir sind heute in der glücklichen Lage, dass es Kristallstrukturen für beide Pigment-Protein-Komplexe gibt, sodass der molekulare Aufbau, insbesondere für Photosystem 1, weitgehend bekannt ist. Da die beiden Photosysteme in all diesen Organismen jeweils sehr ähnlich sind, wird vermutet, dass sich ein Vorläufer der heutigen Cyanobakterien vor langer Zeit in eukaryontische Zellen einlagerte (die heutigen Chloroplasten) und so die Entstehung der Algen und Pflanzen ermöglichte (Endosymbionten-Hypothese).

Die photosynthetische Wasseroxidation zu molekularem Sauerstoff, Protonen und chemisch gebundenen Elektronen erfolgt im Photosystem 2 gemäß folgender Gleichung:

2 H2O + 4 Lichtquanten → O2↑ + 4 H+ + 4 e- (1)

Abbildung 1 zeigt, dass Photosystem 2 in Höheren Pflanzen ein Bestandteil der Thylakoidmembran der Chloroplasten ist. Die Wasseroxidation läuft dabei an einem anorganischen Komplex ab, der aus vier Manganionen, einem Calciumion und einer nicht genau bekannten Anzahl an Sauerstoffbrücken besteht (Mn4OxCa). Die genaue Struktur dieses Katalysators ist noch Gegenstand intensiver Forschung, weshalb vier mögliche Modelle in Abbildung 1 dargestellt sind.

Photosystem 2 besteht aus nahezu 30 Proteinuntereinheiten, die 36 Chlorophyll-, 2 Phäophytin-, 7 Karotin- und 2 Plastochinon-Moleküle binden. Zusätzlich enthält Photosystem 2 den schon erwähnten Mn4OxCa-Komplex, 1-2 Cytochrome, ein nicht-Häm-Eisenion, ein Chloridion und 1-2 Hydrogencarbonate. Abbildung 2 stellt ein vereinfachtes Schema von Photosystem 2 dar, das die ungefähre Anordnung der wichtigsten Proteine und Kofaktoren zeigt. Es wird deutlich, dass alle Elektronentransport-Kofaktoren von nur zwei der ca. 30 Proteine gebunden werden. Diese werden wegen ihrer diffusen Banden in Proteingelen als die D1- und D2-Proteine bezeichnet.
Dennoch ist der hier dargestellte Komplex die minimale Einheit, die unter normalen Bedingungen zur photosynthetischen Wasseroxidation fähig ist. Dies unterstreicht die wichtige Rolle der Proteine für diesen Prozess. Man kann daher auch vermuten, dass es spezifische Kanäle für den Transport von Wasser, O2 und Protonen zu dem fast im Zentrum liegenden Mn4OxCa-Komplex gibt. Für das Design künstlicher Systeme zur Wasserspaltung ist es ferner wichtig zu beachten, dass in vivo ein ausgeklügeltes Reparatursystem existiert, mit dem beschädigte D1- und D2-Proteine schnell gegen neue ausgetauscht werden können.
Die Reaktionsfolgen im Photosystem 2 lassen sich wie folgt zusammenfassen: 1. Lichteinfang, Anregungsenergietransfer und Ladungstrennung, 2. Stabilisierung der Ladungstrennung durch räumliche Trennung der positiven und negativen Ladungen und 3. die Wasseroxidation.
Der Lichteinfang erfolgt mithilfe der bekannten grünen Chlorophyllmoleküle. Abbildung 2 zeigt nur die innere Antenne von Photosystem 2, die von zwei Proteinen gebildet wird, die gemäß ihrer Molekulargewichte von 43 kDa bzw. 47 kDa als CP43 bzw. CP47 bezeichnet werden, wobei CP für ‚Chlorophyll-Protein’ steht. In vivo ist Photosystem 2 noch von mehreren anderen ‚lichtsammelnden’ Chrorophyll-Proteinkomplexen umgeben, sodass in Pflanzen auf jedes Photosystem 2 ca. 250 Chlorophyll-Moleküle kommen. Die Lichtsammelkomplexe der verschiedenen photosynthetischen Organismen unterscheiden sich deutlich. Über deren Anzahl, genaue Zusammensetzung und Anbindung an die beiden Photosysteme werden die gegebenen Lichtverhältnisse optimal ausgenutzt. Die Lichtsammelkomplexe ermöglichen auch den Anregungsenergietransfer in das Reaktionszentrum von Photosystem 2, welches von P680 und einem Phäophytinmolekül im D1-Protein (Abb. 2) gebildet wird. P680 ist nach seinem Absorptionsmaximum benannt und beschreibt eine Gruppe von bis zu vier Chlorophyllmolekülen, die von den D1- und D2-Proteinen gebunden werden. Es besitzt durch seine Struktur und die spezielle Proteinumgebung ein ungewöhnlich hohes Oxidationspotenzial von ungefähr + 1,2 V. Die Ladungstrennung lässt sich vereinfacht wie folgt zusammenfassen:

P680Phäo + 1 Lichtquant → P680+Phäo- (2)

Die beschrieben Reaktionen des Lichteinfangs, der Anregungsenergieleitung und der Ladungstrennung laufen im femto- (10-15) bis piko- (10-12) Sekundenbereich ab und werden von der Arbeitsgruppe Holzwarth in unserem Institut mithilfe von Laserspektroskopie detailliert untersucht (siehe z.B. Jahrbuch 2000).

Diese Ladungstrennung muss schnell stabilisiert werden, damit es nicht zum totalen Energieverlust durch Vereinigung der positiven und negativen Ladungen kommt. Die Wahrscheinlichkeit für eine solche Ladungsrekombination kann durch zwei Strategien verringert werden: 1. räumliche Trennung der Ladungen und 2. Verringerung der Energiedifferenz. Beides erreicht Photosystem 2 durch die Elektronenübertragung auf das Plastochinon QA und nachfolgend weiter auf Plastochinon QB (Abb. 2). Nach erneuter Reduktion und Protonierung wird Plastohydrochinon (QBH2) gebildet, das Photosystem 2 verlässt und durch ein neues Plastochinon aus der Thylakoidmembran ersetzt wird. Die im Plastohydrochinon gespeicherten Elektronen gelangen durch mehrere Zwischenschritte zum Photosystem 1 und werden schlussendlich zur Fixierung von Kohlendioxyd in Form von Kohlenhydraten eingesetzt. Im Fall einer technischen Nutzung wären natürlich die bei der Wasseroxidation freigesetzten Protonen (Gleichung 1) der ideale Empfänger für die Elektronen, da hierdurch der benötigte Energieträger Wasserstoff gebildet würde:

2 H+ + 2 e- → H2 (3)

Diese Reaktion wird tatsächlich von einem Enzym in der Natur katalysiert, das als Hydrogenase bezeichnet wird. Der Reaktionsmechanismus der Hydrogenase wird in der Abteilung von Prof. Lubitz intensiv erforscht [4].
Damit Wasser zu Sauerstoff oxidiert werden kann, muss man gemäß Gleichung 1 zwei Wassermolekülen vier Elektronen in geeigneter Art und Weise entziehen. Es wird daher ein Bindeglied zwischen der Einelektronenchemie der Ladungstrennung (Gleichung 2) und der Vierelektronenchemie der Wasserspaltung (Gleichung 1) benötigt. Dieses Bindeglied ist der schon erwähnte Mn4OxCa-Komplex. Dieser arbeitet gewissermaßen als Akku und speichert sukzessive die vier benötigten positiven Ladungen oder genauer gesagt Oxidationsäquivalente. Hierbei ist noch ein weiterer Kofaktor dazwischen geschaltet, der als Tyrosin Z oder YZ bekannt ist (Abb. 2). Diese Aminosäureseitenkette des D1-Proteins ist redox-aktiv (Einelektronenchemie) und führt zu einer schnellen Reduktion von P680+, wodurch die Wahrscheinlichkeit für eine Ladungsrekombination weiter vermindert wird. Darüber hinaus spekuliert man, ob YZ in seiner oxidierten Form durch H-Atom-Entfernung vom Substratwasser direkt an der Chemie der Wasseroxidation beteiligt ist. Sobald das vierte Oxidationsäquivalent im Mn4OxCa-Komplex vorhanden ist, erfolgt die Wasseroxidation in einer schnellen (1 ms) Dunkelreaktion, in der die beiden teilweise bereits deprotonierten Wassermoleküle je zwei Elektronen an den Mn4OxCa-Komplex abgeben, die O-O-Bindungen formen und als Sauerstoff abgehen. Diese Grundprinzipien der photosynthetischen Wasseroxidation wurden schon vor mehr als 30 Jahren anhand der Viereroszillation in den durch Abfolgen von sehr kurzen Blitzen (Blitzdauer ~10-6 s; Blitzabstand 0,5 s) hervorgerufenen Sauerstoffausbeuten entdeckt und in einem als Kok-Zyklus bekannten Reaktionsschema zusammengefasst (Abb. 3). Die verschiedenen Oxidationszustände des Mn4OxCa-Komplexes werden als Si-Zustände bezeichnet, wobei der Index i = 0, 1, 2, 3, 4 die Zahl der gespeicherten Oxidationsäquivalente angibt.

Neue Messungen zeigen, dass der Mn4OxCa-Komplex nicht nur als Akku arbeitet, sondern auch als Katalysator, indem er die beiden Wassermoleküle in geeigneter Geometrie bindet und im Reaktionszyklus verschiedene Strukturen einnimmt. Für ein genaues Verständnis dieser faszinierenden Reaktion müssen aber noch viele entscheidende Punkte geklärt werden. Hierzu gehören unter anderem: a) die genauen geometrischen Strukturen des Mn4OxCa-Komplexes in den verschiedenen Oxidationszuständen, b) die elektronischen Strukturen des Mn4OxCa-Komplexes in diesen Zuständen, c) die Bindungsstellen und -modi für die beiden Substratwassermoleküle und d) die Bedeutung der Proteine für die photosynthetische Wasseroxidation.
Diese Fragen werden in der Arbeitsgruppe Messinger mit verschiedenen biophysikalischen Methoden untersucht. Die in Zusammenarbeit mit Dr. V. K. Yachandra (Berkeley, USA) durchgeführten röntgenspektroskopischen Experimente erlauben hierbei sowohl die Untersuchung der geometrischen Struktur (EXAFS), als auch der elektronischen Struktur (XANES, Kβ XES, RIXS). Die hiermit erarbeiteten Strukturvorschläge für den S1-Zustand des Mn4OxCa-Komplexes sind in Abbildung 1 (unten rechts) dargestellt. So konnte z.B. kürzlich eine Strukturänderung für den S0 → S1-Übergang nachgewiesen werden, die auf eine Deprotonierung einer Mn-OH-Mn- Brücke in diesem Schritt schließen lässt [6]. Weitere Aufschlüsse über die geometrische Struktur werden von den gegenwärtig durchgeführten orientierungsabhängigen EXAFS-Experimenten an Photosystem-2-Einkristallen erwartet. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Lubitz wird die Aufklärung der elektronischen Struktur der Si-Zustände mithilfe modernster Elektronenspinresonanzverfahren vorangetrieben. Abbildung 4 zeigt 55Mn ENDOR-Spektren vom S2-Zustand im X- und Q-Band, die neue Einblicke in diese komplizierte Frage erlauben. Zum Verständnis dieser Ergebnisse sind vergleichende Messungen an strukturell bekannten Modellverbindungen unerlässlich, wofür eine Zusammenarbeit mit der Abteilung Wieghardt besteht.

Die Bindung der Substratwassermoleküle an den Mn4OxCa-Komplex wird in der Arbeitsgruppe Messinger mit zeitaufgelöster Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie untersucht [7]. Hierfür werden die Photosystem-2-Proben zunächst in normalem Wasser (H216O) in den gewünschten Si-Zustand vorgeblitzt und dann innerhalb von wenigen Millisekunden mit dem isotopenmarkierten Wasser (H218O) versetzt. Mit einer weiteren Blitzfolge wird dann Sauerstoff freigesetzt und mit dem Massenspektrometer über ein Membraneinlasssystem online detektiert. Die Geschwindigkeit, mit der H218O mit dem bereits im Photosystem 2 gebundenen H216O austauscht, kann durch Variation der Mischzeit und den so verursachten Änderungen der Signalintensitäten für 16,16O2, 16,18O2 und 18,18O2 bestimmt werden. Durch Messungen an Mutanten werden gegenwärtig die Substrat-Bindungsstellen und mögliche Wasserkanäle untersucht. Ferner werden Isotopeneffekte und die Rolle von Hydrogencarbonat in der photosynthetischen Wasseroxidation analysiert.

Literatur

[1] P. Jordan, P. Fromme, H. T. Witt, O. Klukas, W. Saenger, N. Krauß: Nature 411, 909-917 (2001).

[2] A. Zouni, H.-T. Witt, J. Kern, P. Fromme, N. Krauß, W. Saenger, P. Orth: Nature 409, 739-743 (2001).

[3] K. N. Ferreira, T. M. Iverson, K. Maghlaoui, J. Barber, S. Iwata: Science 303, 1831-1838 (2004).

[4] M. Brecht, M. van Gastel, T. Buhrke, B. Friedrich, W. Lubitz: Journal of the American Chemical Society 125, 13075-13083 (2003).

[5] B. Kok, B. Forbush, M. McGloin: Photochemistry and Photobiology 11, 457-475 (1970).

[6] J. H. Robblee, J. Messinger, R. M. Cinco, K. L. McFarlane, C. Fernandez, S. A. Pizarro, K. Sauer, V. K. Yachandra: Journal of the American Chemical Society 124, 7459-7471 (2002).

[7] J. Messinger, M. Badger, T. Wydrzynski: Proceedings of the National Academy of Sciences 92, 3209-3213 (1995).

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