Forschungsbericht 2014 - Max Planck Florida Institute for Neuroscience

Signalübertragung in Nervenzellen

Autoren
Yasuda, Ryohei
Abteilungen
Neuronal Signal Transduction
Zusammenfassung
Synaptische Plastizität - die Fähigkeit von Synapsen, ihre "Bandbreite" zu variieren - wird als eine Grundvoraussetzung für Lern- und Erinnerungsvermögen betrachtet. Es gibt viele Formen von synaptischer Plastizität, die man in kleinsten post-synaptischen Kompartimenten, sogenannten dendritischen Dornen, findet. Dendritische Dornen – kleine Protuberanzen auf der Oberfläche von Nervenzellen – sind diejenigen Elemente, die unser Gehirn nutzt, um Informationen zu speichern. Neue Technologien erlauben nun, biochemische Prozesse in einzelnen dendritischen Dornen direkt zu beobachten.

Calcium als Botenstoff für Synaptische Plastizität

Um synaptische Plastizität und damit die Fähigkeit unseres Gehirns, zu lernen und Informationen zu speichern, im Detail zu verstehen, muss man die Funktion der verschiedenen Ionenströme und die von ihnen ausgelösten biochemischen Kaskaden an Botenmolekülen genau analysieren können.

Das Einströmen von Ca2+ Ionen in dendritischen Dornen löst eine Kaskade von biochemischen Signalübertragungen aus, die verschiedene Versionen von synaptischer Plastizität generieren können, unter anderem Langzeit-Potenzierung (LTP) und Langzeit-Depression (LTD). In den letzten Jahrzehnten wurden Hunderte von Proteinen identifiziert, die wichtige Komponenten für diejenige Signalübertragung darstellen, die letztendlich zu synaptischer Plastizität führt. Diese verzweigen sich mit anderen Signalproteinkaskaden und bilden komplizierte Signalnetzwerke aus, deren unterschiedliche Effekte als Antwort auf dynamische Ca2+ Signale im Moment noch völlig unverstanden sind.

In Nervenzellen kann die Dynamik von biochemischen Signalen auf subzelluläre Kompartimente in stark variierenden Größenordnungen beschränkt werden - von dendritischen oder axonalen Verästelungen (> 10 µm) über kleinste dendritische Dornen oder "Boutons" (~ 1 µm) bis zu hinunter zu nur Nanometer-großen Signalprotein-Komplexen und Rezeptoren. Diese Abgrenzungen der Signalprozesse beeinflussen die räumliche und zeitliche Dynamik der Signalübertragung und spielen eine große Rolle dabei, spezifische extrazelluläre Signale mit den entsprechenden intrazellularen Signalkaskaden zu verbinden.

Vor allem die dendritischen Dornen stellen mit ihren eigenen Ionenkanälen, Rezeptoren, Gerüstproteinen und Enzymen innerhalb eines extrem kleinen Zellvolumen (etwa 0,1 Femtoliter) ein einzigartiges Umfeld dar. Dendritische Dornen sind zu korrespondierenden Dendriten über einen kleinen „Hals“ verbunden, der als Diffusionsbarriere wirkt. Die Signalaktivität innerhalb der einzelnen Dornen ist zu einem gewissen Grad von anderen Dornen abgegrenzt und unabhängig reguliert. Nichtsdestotrotz nimmt man an, dass mehrere Synapsen zusammen die Signalweiterleitung beeinflussen können. Deshalb ist es außerordentlich wichtig, die räumliche und zeitliche Abfolge der Signalübertragung besser analysieren zu können, um diejenigen Mechanismen zu verstehen, die verschiedene Effekte nach einem jeweiligen Ca2+ Signal auf die Plastizität der Nervenzellen haben. 

Die Entwicklung einer neuen Visualisierungstechnik, basierend auf 2-Photonen Fluorescence-Lifetime-Imaging-Microscopy (2pFLIM) und speziell verbesserten Biosensoren, erlaubt es nunmehr, diese Probleme zu überwinden und Signalaktivitäten in einzelnen synaptischen Kompartimenten unter physiologischen Bedingungen zu analysieren [1]. Das Ziel dieser Forschung ist Technologien zu entwickeln, die es ermöglichen, die notwendige räumliche und zeitliche Auflösung der Interaktionen von Signalproteinen in individuellen dendritischen Dornen zu visualisieren und dadurch Aufschlüsse auf die Generierung von verschiedenen Formen synaptischer Plastizität und deren Dynamik zu erhalten. 

Visualisierung der Signalübertragung in einzelnen dendritischen Dornen

Um die Signalmechanismen, die für synaptische Plastizität notwendig sind, besser zu verstehen, wurden Biosensoren entwickelt, die es erlauben, die Aktivität von Signalproteinen wie CaMKII, Cdc42, RhoA und ERK in einzelnen Dornen mithilfe von 2pFLIM und lichtaktivierter Glutamatfreisetzung zu visualisieren. Bei dieser Technik werden chemisch modifizierte Glutamatmoleküle über Laserpulse "aktiviert" und erlauben so eine gezielte Signalauslösung in einzelnen Dornen.

Dabei zeigte sich, dass eine komplexe räumliche und zeitliche Abstimmung zur Erzeugung von Plastizität in individuellen Dornen nötig ist. CaMKII und Cdc42 Signale sind auf individuelle Synapsen begrenzt, während RAS und RhoA sich über eine begrenzte Distanz (5-10 µm) über die Dendriten verteilen und über mehrere Dornen hinweg agieren (Abb. 1). Diese vielfältige räumliche und zeitliche Kontrolle spielt eine entscheidende Rolle, um zelluläre Reaktionen innerhalb der Dornen und der Dornenhälse zu koordinieren. Danach wurde versucht herauszufinden, inwieweit Signale, die an einzelnen dendritischen Dornen erzeugt wurden, in den Zellkern übertragen werden und dort Gentranskription regulieren könnten.

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Abb. 1:  Aktivierung von RhoA in einzelnen dendritischen Dornen während der Induktion von struktureller Plastizität, induziert durch 2-pFLIM und laseraktivierte Glutamatfreisetzung (weißer Pfeil). s, Sekunden; ns, Nanosekunden; uncaging, laseraktivierte Glutamatfreisetzung.

Die Wissenschaftler fanden außerdem, dass eine Zunahme an Ca2+ in der Synapse auf verschiedenen Niveaus weiterverarbeitet wird. Zum einen werden Ca2+ Signale von dem Signalprotein CaMKII über einen Zeitraum von etwa 10 s integriert. Daraufhin aktiviert CaMKII die Signalproteine Ras, Cdc42 und RhoA, und damit wird das temporäre Signal in neue Signale, die etwa 10-30 s dauern, übersetzt. Ras, Cdc42 und RhoA reorganisieren das Aktin-Zytoskelett in der Synapse, was langfristig zu einer Vergrößerung der Dorne und damit zu synaptischer „Verstärkung“ führt. Genau diese Langzeitsignale könnten Teil derjenigen Mechanismen sein, die die biochemische Informationsspeicherung in den Synapsen auslösen [2].

Die extrazelluläre, signalregulierte Kinase ERK ist sowohl für die Signalübertragung innerhalb einer stimulierten Dorne wichtig, spielt aber auch für die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren im Zellkern während LTP eine bedeutende Rolle.  Deshalb überprüfte die Forschergruppe die Hypothese, ob Signaltransmission von der Dorne zum Zellkern durch ERK erfolgt. Überraschenderweise scheint es, dass die Induktion von LTP in nur sehr wenigen Dornen - drei bis fünf - zur Aktivierung von ERK im Zellkern und der anschließenden Regulierung der nachgeordneten Transkriptionsfaktoren CREB und Elk-1 führte [3]. Obwohl jede pyramidale CA1 Nervenzelle Information von ungefähr 10.000 Synapsen bekommt, kann schon die Aktivierung von sehr wenigen dieser Synapsen (< 0,1%) eine biochemische Reaktion im Zellkern auslösen und die Transkription von Genen regulieren. In diesen Experimenten wurden die Signale über eine sehr große zeitliche (> 30 min) und räumliche (> 80 µm) Spanne analysiert und es konnte gezeigt werden, dass räumlich getrennte Signale sehr viel effizienter zu einer Aktivierung von nachgeordneter Transkription führten als nahe beieinander liegende Stimuli auf dem gleichen dendritischen Ast. Damit konnten wichtige Erkenntnisse über die Signaltransmission von individuellen dendritischen Dornen in den Zellkern gewonnen werden.

Lichtaktivierte intrazelluläre Signalübertragung 

Neben der Analyse der verschiedenen Elemente in Signalkaskaden ist es ebenso wichtig Instrumente zu entwickeln, die es erlauben die Signalübertragung zu manipulieren, um so wichtige Aufschlüsse auf den Informationsfluss der Signalnetzwerke zu erhalten.

In der Vergangenheit wurden bereits einige photoaktivierte Proteine generiert, die es ermöglichen, kleinere GTPasen und auch Genetranskription mit Licht zu aktivieren. Es ist leider nicht so einfach, diese Strategien ohne weiteres auf andere Proteine auszuweiten. Es wurden daher neuartige, photo-induzierbare Inhibitoren entwickelt, die auf einer Licht-Sauerstoff Spannungsdomaine II (LOV2)-Jα Helix-Domaine von Phototropin 1 basieren. Mit dieser Methode konnte eine photoinduzierter CaMKII Inhibitor generiert werden (Abb. 2). Sobald die Zellen im Verlauf der Glutamatfreisetzung gleichzeitig mit blauem Licht bestrahlt wurden, konnte die Induktion von struktureller Plastizität komplett unterbunden werden. Wenn das Blaulicht allerdings nur eine Minute nach der Glutamatfreisetzung eingesetzt wurde, war kein Effekt mehr zu sehen. Das erlaubt die Schlussfolgerung, dass nur eine Minute an CaMKII vermittelter Signalübertragung genügt, um eine Reaktion im Zellkern auszulösen. Diese Ergebnisse werden ebenfalls durch Experimente mit fluoreszierenden CaMKII Sensoren bestätigt.

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Abb. 2: Photoaktiviertes AIP2 (paAIP2) inhibiert lichtabhängig CaMKII. A, Illustration der Wirkungsweise von paAIP2. B, Blaulichtbeleuchtung während der Glutamatfreisetzung inhibiert strukturelle Plastizität von dendritischen Dornen in Nervenzellen, die paAIP2 produzieren. Wenn Blaulicht erst eine Minute nach der Glutamatfreisetzung appliziert wird, ist die strukturelle Plastizität nicht inhibiert (rechtes Bild). AIP2, autocamtide CaMKII inhibitory peptide-2; uncaging, Glutamatfreisetzung; blue light, Blaulichtbeleuchtung.

Diese Strategie kann nun weiter auf andere Signalproteine, wie zum Beispiel Proteinkinase A und C, ausgedehnt werden. Innovative Sensoren dieser Art ermöglichen es zukünftig, auch die zeitliche Zusammenwirkung von Signalen in Nervenzellen weiter aufzulösen. 

Zurzeit werden transgene Mäuse erzeugt, die den Blaulicht induzierten CaMKII Inhibitor als transgenes Protein produzieren. Mithilfe von optischen Glasfasern, die in bestimmte Gehirnregionen eingeführt werden, und einem aktivierbaren Expressionssystem kann CaMKII lokal und zeitlich begrenzt inhibiert und damit der Effekt einer solchen lokalen Intervention auf das Lernvermögen eines Tieres untersucht werden.

Visualisierung von struktureller Plastizität im Nanometerbereich

Während der Ausbildung von LTP assoziierter struktureller Plastizität nach einer starken synaptischen Stimulierung nimmt das Volumen von dendritischen Dornen sehr schnell (< 1 min) auf das zwei bis fünffache zu und hält sich dann über einen längeren Zeitraum von mehreren Stunden auf ungefähr dem zweifachen Volumen aufrecht. Der Mechanismus dieses schnellen Volumenzuwachses und der Stabilisierung des Dornenvolumens ist bis heute noch völlig unbekannt, unter anderem wegen fehlender technischer Möglichkeiten, diejenigen Dornen, die am Auflösungslimit der optischen Mikroskope liegen, visuell zu analysieren; denn es ist nötig, die strukturellen Veränderungen in lebenden Zellen mit räumlicher Auflösung im Nanometerbereich zu visualisieren.

Das Forscherteam hat einen völlig neuartigen Ansatz entwickelt, um diese dynamischen Prozesse visuell darzustellen. Dieser basiert auf hochauflösender Hochgeschwindigkeits-Atomic Force Mikroskopie (AFM). Ein Hochgeschwindigkeits-AFM für die Visualisierung von Konformationsveränderungen einzelner Proteine, mit dem sich auch die Struktur von Mikroorganellen mit sekundenschneller und Sub-Nanometerauflösung darstellen lässt, war bereits optimiert worden [4]. Dieser Ansatz wurde weiterentwickelt, um größere und potenziell dynamischere Systeme wie dendritische Dornen in dissoziierten Nervenzellen analysieren zu können. Damit konnten zum Beispiel bereits Bilder von retrogradem Aktinfluss und Endocytose in HeLa Zellen aufgenommen werden (Abb. 3). 

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Abb. 3. Endocytose auf der Zellmembranoberfläche von HeLa Zellen, mit Hochgeschwindigkeits-Atomic Force Mikroskopie (AFM) sichtbar gemacht. Protuberanzen formieren sich an der Seite der Einbuchtungen und verschließen diese.

Durch die Darstellung struktureller Veränderungen von dendritischen Dornen mit Nanometerauflösung wird es hoffentlich möglich werden, einen besseren Einblick in die Morphogenese der Dornenbildung zu erhalten. Spannende Fragen sind zum Beispiel die nach den Veränderungen an der Wachstumsfront wachsender Dornen, wo sich wahrscheinlich Filipodien und „Rufflebildung“ direkt darstellen lassen sollten. Diese wurden schon indirekt mit optischen Methoden postuliert, konnten bis jetzt aber noch nicht direkt visualisiert werden. Die Wissenschaftler hoffen, damit auch die Lokalisation und Zeitabläufe von Exozytose und Endozytose, die bei der Regulation von Membranstrukturen ein wichtige Rolle spielen, jedoch mit optischen Methoden bis jetzt nicht aufgelöst werden konnten, zu identifizieren. 

Moleküle und Krankheiten

Es wird angenommen, dass viele Krankheiten des Nervensystems durch fehlerhafte Signalübertragung an den Synapsen verursacht werden. Mit den hier vorgestellten neuentwickelten Technologien kann man jetzt in tierischen Krankheitsmodellen an individuellen Synapsen direkt analysieren, wie die Signalübertragung spezifisch gestört ist.

Neurofibromatosis Typ 1.  Diese Krankheit wird durch eine funktionsbeeinträchtigende Mutation im Nf1 Gen verursacht und mit Lerndefiziten assoziiert. Nf1 kodiert Neurofibromin, ein Protein mit verschiedenen Funktionen, das unter anderem auch Ras inaktiviert. Neurofibromin befindet sich in dendritischen Dornen von pyramidalen Nervenzellen und reguliert auch die Dornendichte. Bis jetzt ist aber noch nicht bekannt, wie die Inaktivierung von Ras durch Neurofibromin zeitliche und räumliche Expressionsmuster von Ras in den dendritischen Dornen beeinflusst.

Um die genaue Funktion von Neurofibromin für die Dornenplastizität zu untersuchen, wurde Ras mithilfe der 2pFLIM Visualisierungstechnik während der Plastizitätsinduktion in Nervenzellen analysiert. In diesen Nervenzellen wurde die Poduktion von Neurofibromin durch sh-RNA (short hairpin RNA) temporär unterdrückt. Wir fanden, dass Neurofibromin hauptverantwortlich für die Inaktivierung von Ras in den dendritischen Dornen ist (Abb. 4). Die temporäre Reduktion der Expression von Neurofibromin in den Dornen verursachte eine langanhaltende Aktivierung von Ras, die wiederum zu einer Beeinträchtigung der strukturellen Dornenplastizität und dem Verlust von Dornen in einer aktivitätsabhängigen Weise führte. Die Fehlregulierung von postsynaptischen Ras-abhängigen Signalmechanismen könnte deshalb wenigstens teilweise für solche Lerndefizienzen verantwortlich sein, die mit NF1 einhergehen.

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Abb. 4. Ras Aktivierung wird in Nervenzellen aufrechterhalten, in denen Neurofibrominproduktion unterdrückt ist. sh-NF1, shRNA gegen Neurofibromin; sc-shRNA, inaktive shRNA Kontrolle; uncaging, Glutamatfreisetzung.

Alzheimer Krankheit. Diese Erkrankung wird vermutlich von β-Amyloid Peptid (Aβ)-abhängigen synaptischen Funktionsstörungen verursacht. Allerdings sind die Signalwege, die Aβ mit den synaptischen Funktionsbeeinträchtigungen verbinden, noch völlig unbekannt. In Zellkulturen aus der Hippocampus Region wurde gefunden, dass Aβ kurzfristig die Produktion des Proteins Centaurin-α1 (CentA1) in Nervenzellen steigert, welches dann seinerseits die von Ras abhängige Bindung eines Proteins namens Elk-1 an Mitochondrien verursacht und so Funktionsstörungen in den Mitochondrien auslöst. Diese Störungen sind wahrscheinlich auch der Grund für die synaptischen Funktionsbeeinträchtigungen und den Verlust an dendritischen Dornen [5]. Genetische oder medikamentöse Unterdrückung des CentA1-Ras-Elk-1 Signalweges konnte die normale Funktion der Mitochondrien, eine normale Dornendichte, die Plastizität und die Signalübertragung an den Synapsen wiederherstellen. Eine Überexpression von CentA1 allein war schon ausreichend, um einen markanten Verlust der normalen Dornendichte an den Dendriten auszulösen. Höhere CentA1 Niveaus und die Assoziierung von Elk-1 mit Mitochondrien konnten auch in transgenen Mäusen beobachtet werden, die eine mutierte Form des humanen Amyloid Precursor Proteins (APP) in Nervenzellen produzieren.

Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass der CentA1-Ras-Elk-1 Signalweg in den Nervenzellen des Hippocampus direkt auf die Mitochondrien einwirkt und sowohl die Dichte der Dornen als auch deren synaptische Plastizität beeinflusst. Weitere Studien in CentA1 Knock-Out Mäusen werden sich nun der Rolle von CentA1 auf das Lernverhalten widmen und mit Sicherheit weitere Erkenntnisse über die genauen Ursachen der Alzheimer Erkrankung ermöglichen.

Literaturhinweise

1.
Oliveira, A. F.; Yasuda, R.
An improved Ras sensor for highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging
PLoS ONE 8, e52874 (2013)
DOI: 10.1371/journal.pone.0052874
2.
Murakoshi, H.; Wang, H.; Yasuda, R.
Localized, persistent activation of Rho GTPases during long-term structural plasticity induced in single dendritic spines
Nature 472, 100-104 (2011)
DOI: 10.1038/nature09823
3.
Zhai, S.; Ark, E. D.; Parra-Bueno, P.; Yasuda, R.
Long-distance integration of nuclear ERK signaling triggered by activation of a few dendritic spines
Science 342, 1107–1111 (2013)
DOI: 10.1126/science.1245622
4.
Watanabe, H.; Uchihashi, T.; Kobashi, T.; Shibata, M.; Nishiyama, J.; Yasuda, R.; Ando, T.
Wide-area scanner for high-speed atomic force microscopy
Review of Scientific Instruments 84, 053702 (2013)
DOI: 10.1063/1.4803449
5.
Szatmari, E. M.; Oliveira, A. F.; Johnson, E. B.; Yasuda, R.
Centaurin-α1-Ras-Elk-1 signaling at mitochondria mediates β-amyloid-induced synaptic dysfunction
Journal of Neuroscience 33, 6081-6092 (2013)
DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2641-12.2013
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