Forschungsbericht 2013 - Max-Planck-Forschungsstelle für Enzymologie der Proteinfaltung

Proteinfunktionen und Foldasekatalyse

Autoren
Fischer, Gunter
Abteilungen
Enzymologie der Proteinfaltung
Zusammenfassung
Foldasen steuern langsame Faltungsprozesse in Proteinen, wobei diese Reaktionen im Gehirn von Alzheimerpatienten gestört sind. Schon zu Beginn eines Faltungsvorganges entstehende, missgefaltete Produkte können hier toxisch wirken. Foldasen besitzen ein für die Faltung zuständiges aktives Zentrum, das den Übergangszustand der Strukturierung stabilisiert. Kann die gleichzeitige Hemmung von zwei Foldasefamilien durch miteinander verbundene Inhibitoren eine neue Qualität im zellulären Faltungsgeschehen mit sich bringen? Daten, erhalten in einem Tiermodell für Multiple Sklerose, legen dies nahe.

Einleitung

Bei verschiedenen Krankheitszuständen wie Krebs, chronischen Entzündungen oder auch viralen Infektionen wird eine überschießende und deswegen schädliche Aktivität von Foldasen beobachtet. Diese kann durch Hemmstoffe auf ein weniger gefährliches Niveau abgesenkt werden. Deswegen werden diese Stoffe bereits heute so entwickelt und optimiert, dass sie später einmal  als Medikamente zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden können. Eine möglichst gute Hemmwirkung bei niedrigen Wirkstoffkonzentrationen, eine breite Abdeckung aller relevanten Schadaktivitäten und wenig Nebenwirkungen spielen dabei eine entscheidende Rolle.

Duale Inhibitoren können mehr als Gemische der Einzelwirkstoffe

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Abb. 1 (a): Dualer Foldaseinhibitor, der in der Lage ist, sowohl Cyclophiline als auch FK506-bindende Proteine mit hoher Affinität zu binden und deren Foldaseaktivität zu hemmen.
Abb. 1 (a): Dualer Foldaseinhibitor, der in der Lage ist, sowohl Cyclophiline als auch FK506-bindende Proteine mit hoher Affinität zu binden und deren Foldaseaktivität zu hemmen.

Hohe Foldaseaktivitäten am falschen Ort und zur unrechten Zeit können zu Faltungsproblemen führen. Deswegen ist die spezifische Hemmung von Foldaseaktivitäten als ein Weg bei der Medikamentenentwicklung sinnvoll. Hemmstoffe für Foldasen vom Typ der Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIasen) mit ihren Vertretern aus der Familie der Cyclophiline oder der FK506-bindenden Proteine sind niedermolekulare Wirkstoffe, die für ihr jeweiliges Zielenzym hochaffin sind, aber keine Kreuzinhibition mit der anderen Foldasefamilie zeigen. Für die Cyclophiline sind es die Cyclosporine, Sanglifehrin oder auch Aryl-Indanylketone, für die FK506-bindenden Proteine sind es das Peptidmakrolid FK506 oder N-Alkylcycloheximid-Derivate. Bifunktionale, duale Inhibitoren sind solche, die jeweils eine „Kopfgruppe“ spezifisch für jeweils eine Foldasefamilie aufweisen. Beide „Kopfgruppen“ sind durch chemische Verbindungselemente unterschiedlicher Struktur und Länge kovalent miteinander verknüpft. Von physikalischen Gemischen beider Inhibitoren unterscheiden sich die dualen Inhibitoren grundsätzlich: In der Zelle wirksam werden nicht nur die in Abbildung 1a aufgeführten Moleküle, sondern auch solche, die jeweils schon einen zelleigenen Vertreter  an einer Seite des dualen Inhibitors gebunden haben (Abb. 1b).  So können die toxischen und immunsuppressiven Nebenwirkungen der isolierten Kopfgruppen vermieden werden.

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Abb.1(b): Sequenzielle Bindung von Foldasen an einen dualen Inhibitor (schwarz), hier schematisch dargestellt anhand der Bindung erst an zelleigenes Cyclophilin A (CypA*) und anschließend Bindung des gebildeten, hochmolekularen binären Komplexes an FKBP12*. Das Sternchen bedeutet, dass die zelleigenen Proteine und nicht von außen zugesetzte die Bindung vermitteln.
Abb.1(b): Sequenzielle Bindung von Foldasen an einen dualen Inhibitor (schwarz), hier schematisch dargestellt anhand der Bindung erst an zelleigenes Cyclophilin A (CypA*) und anschließend Bindung des gebildeten, hochmolekularen binären Komplexes an FKBP12*. Das Sternchen bedeutet, dass die zelleigenen Proteine und nicht von außen zugesetzte die Bindung vermitteln.

Auf Grundlage der biochemischen Eigenschaften dieser dualen Inhibitoren haben die Gruppen von Gunter Fischer, Max-Planck-Forschungsstelle, und von Frank Striggow, Forschungszentrum für Neurodegenerative Erkrankungen der Helmholtz-Gesellschaft, Magdeburg, deren Einfluss in einer experimentell erzeugten allergischen Enzephalomyelitis untersucht. Dabei handelt es sich um eine Erkrankung des Zentralen Nervensystems bei Mäusen, die als Tiermodell für die menschliche Multiple Sklerose gilt.

Multiple Sklerose ist eine entzündliche Erkrankung des Zentralen Nervensystems. Sie zerstört die Isolierung der Leitungsbahnen von Nervenzellen, die sogenannten Myelinscheiden der neuronalen Axone. Dieser Prozess führt zur Störung der Signalleitung und schließlich zum Tod der betroffenen Nervenzellen. Die Folge sind permanente neurologische Störungen. Ursache der Multiplen Sklerose sind körpereigene Angriffe auf die zellulären Bestandteile der Myelinscheiden, die Oligodendrozyten, die Hirnzellen gegen diese Angriffe schützen. Ziel einer Behandlung ist es nicht nur, die Schädigung und den Verlust von Hirnzellen zu verhindern, sondern auch die Regeneration der Zellen positiv zu beeinflussen.

In Mäusen, die an allergischer Enzephalomyelitis erkrankt sind, führt die Behandlung mit einem der in Abbildung 1 aufgeführten dualen Inhibitoren zu einer deutlichen Verbesserung der krankheitsbedingten Symptomatik, z. B. der Bewegungsstörungen [1]. Noch sind die an der Krankheitsentwicklung beteiligten Isoformen der Cyclophiline und FK506-bindenden Proteine in den Nervenzellen nicht bekannt, und die Inhibitoren können deswegen noch nicht auf die jeweilige Krankheit hin maßgeschneidert werden. Die Wissenschaftler in Halle und Magdeburg arbeiten daran, die Wirkungsweise der dualen Inhibitoren auf der molekularen Ebene aufzuklären.

Aβ-Oligomere, die mutmaßlichen Auslöser der Alzheimer-Krankheit

In der Forschungsstelle in Halle werden Untersuchungen für eine weitere neurodegenerative Erkrankung, Morbus Alzheimer, durchgeführt. Sie ist verbunden mit der Falschfaltung des Amyloid-ß-Polypeptides (Aß). Manche dieser Faltungsprozesse sind abhängig von der katalytischen Wirkung einer neuronalen Foldase, der PPIase Pin1. Marcus Fändrich und seine Gruppe untersuchen potenziell therapeutische Ansätze, bei denen toxische Faltungsintermediate mit Hilfe von Antikörper-Fragment gegen Aβ-Oligomere neutralisiert werden. Neue molekulare Sonden zur Charakterisierung der Falschfaltungsmechanismen von Aß werden in den Arbeitskreisen von Gunter Fischer und Cordelia Schiene-Fischer entwickelt.

Aktuelle Schätzungen gehen allein in Deutschland von circa einer Million Alzheimer-Patienten aus. Trotz intensiver Forschung sind die genauen molekularen Ursachen der Krankheit noch nicht abschließend geklärt. Vieles deutet aber darauf hin, dass die Bildung von faserförmigen Strukturen, sogenannten Amyloidfibrillen, ein zentrales Element in der Krankheitsentstehung darstellt. Diese Fibrillen bestehen aus dem Peptid Aβ, doch sind es wohl weniger die Fibrillen selbst, die die Nervenzellen schädigen, als vielmehr Zwischenprodukte der Fibrillenbildung, sogenannte Oligomere. Aβ-Oligomere ändern die Funktionen von kultivierten Nervenzellen, zum Beispiel indem sie deren wechselseitige Verschaltung über Synapsen beeinflussen. Betroffene neuronale Netzwerke zeigen verminderte Gedächtnisleistungen und in der Folge kann es sogar zum Absterben der Zellen kommen. Um diese Effekte von Oligomeren besser verstehen zu können, ist es wichtig, über Werkzeuge zu verfügen, die die schädlichen Aβ-Strukturen gezielt erkennen.

In Zusammenarbeit mit Wissenschaftlern in Halle (Saale), Jena und Magdeburg ist es nun gelungen, mit einem biotechnologischen Verfahren ein Antikörper-Fragment herzustellen, welches Oligomere erkennt und ihre neuronenschädliche Wirkung blockiert [2]. Antikörper spielen seit vielen Jahren in der Alzheimer-Forschung eine große Rolle, da sie einen Schlüssel für die Behandlung betroffener Patienten liefern könnten. Allerdings konnte damit trotz mehrerer klinischer Studien noch kein entscheidender Durchbruch erzielt werden. Antikörper sind körpereigene Proteine, die das Immunsystem herstellt, um Krankheitserreger zu erkennen und auszuschalten. Dabei ist aber stets nur ein kleines Fragment des Antikörpers für seine Bindungs- und Erkennungseigenschaften verantwortlich. Ein solches Antikörper-Fragment mit Namen KW1 konnte nun isoliert werden (Abb. 2). KW1 bindet Oligomere, nicht aber das monomere Peptid oder die Aβ-Fibrillen. Darüber hinaus ist KW1 in der Lage, zwischen verschiedenen Oligomeren zu differenzieren, und ist somit deutlich spezifischer als viele frühere Oligomer-bindende Moleküle.

Durch einen Vergleich mit Patientenmaterial konnten die Forscher belegen, dass die von KW1 erkannten oligomeren Strukturen im Gehirn von betroffenen Patienten vorkommen. Zugabe von sub-stöchiometrischen Mengen von KW1 verhindert oder verzögert außerdem die Fibrillierung des Aβ-Peptids. Es ist also möglich, mit dem neu gewonnenen Antikörper-Fragment einen bestimmten Schritt in der Fibrillierungskaskade anzusteuern und gegebenenfalls auszuschalten. In der Tat konnte KW1 den schadhaften Effekt von Aβ-Oligomeren auf die „Gedächtnisleistung“ von in Kultur gehaltenen neuronalen Netzwerken verhindern. Doch werden die Hauptanwendungsmöglichkeiten von KW1 weniger in der Therapie als vielmehr in der Grundlagenforschung vermutet. Insbesondere dienen die Antikörper-Fragmente zur molekularen Unterscheidung der verschiedenen Aβ-Aggregate.

So konnten durch einen Vergleich mit einem zuvor gewonnenen Antikörper-Fragment mit Namen B10 [3], welches Fibrillen statt Oligomere bindet, verschiedene Assemblierungsstufen von Aβ voneinander unterschieden werden. Die Untersuchungen lieferten aber auch Einblicke in den Aufbau der erkannten Aggregate. Sie zeigten, dass Oligomere an ihrer Oberfläche einen höheren Anteil an exponierten hydrophoben chemischen Gruppen aufweisen, wodurch die Bindung von KW1 erst möglich wird. Derartige Oberflächeneigenschaften scheinen Amyloidfibrillen zu fehlen, und ihre Wechselwirkung mit B10 beruht daher auch eher auf elektrostatischen Wechselwirkungen und auf einem regelmäßigen Oberflächenmuster der Fibrillen [4, 5]. Dieses Muster ist eine Folge ihrer hochgeordneten, regulären Struktur. Die höhere Oberflächen-Hydrophobizität von Oligomeren scheint schließlich entscheidend zu ihrer höheren Pathogenität beizutragen und ermöglicht zum Beispiel ihre bessere Wechselwirkung mit Zelloberflächen.

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Abb. 2: Atomare Struktur der Aß-Oligomer-bindenden Domäne des Antikörpers KW1
Abb. 2: Atomare Struktur der Aß-Oligomer-bindenden Domäne des Antikörpers KW1

Die Aß-Fibrillierung  hängt von den Eigenschaften bestimmter Peptidbindungen ab

Um neue Faltungssonden für die Aß-Aggregation zu entwickeln, mussten die Wissenschaftler um Gunter Fischer und  Marcus Fändrich zunächst von den eigentlich im Organismus vorhandenen toxischen Aggregaten der 39 bis 42 Aminosäuren langen Aß-Ketten abgehen.  Es wurde bereits gezeigt, dass kürzere Ketten mit der Aminosäuresequenz 16 bis 22 (Aβ16‐22) ebenfalls amyloide Plaques bilden, sodass die Wissenschaftler, ausgehend von der Oxopeptid-Sequenz Ac‐Lys‐Leu‐Val‐Phe‐Phe‐Ala‐Glu‐NH2 alle Peptidbindungen nacheinander durch die schwefelhaltigen Thioxopeptidbindungen ersetzt haben. Sechs  Monothioxopeptide wurden erzeugt und auf ihr Aggregationsverhalten hin untersucht.

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Abb. 3: Zeitabhängigkeit der Fibrillenbildung von Ac‐Lys‐Leu‐Val‐Phe‐Phe‐Ala‐Glu‐NH2 (50 µM, schwarz) gemessen mit Hilfe des Anstieges der Thioflavinfluoreszenz bei 27°C. Nach ca. 40 h liegt das Oxopeptid weitgehend in der fibrillierten Form vor. Ein Peptid mit einer Thioxopeptid-Gruppe zwischen Phe-[CS-NH]-Phe (100 µM, rot) fibrilliert nicht, während die minimale Verschiebung des Schwefelatoms hin zur Phe-[CS-NH]-Ala-Position (100µM, grün) zu einem Fibrillierungsverhalten ähnlich dem Oxopeptid führt. Die durchgezogenen Linien stellen eine sigmoidale Anpassung an die experimentellen Messpunkte dar.
Abb. 3: Zeitabhängigkeit der Fibrillenbildung von Ac‐Lys‐Leu‐Val‐Phe‐Phe‐Ala‐Glu‐NH2 (50 µM, schwarz) gemessen mit Hilfe des Anstieges der Thioflavinfluoreszenz bei 27°C. Nach ca. 40 h liegt das Oxopeptid weitgehend in der fibrillierten Form vor. Ein Peptid mit einer Thioxopeptid-Gruppe zwischen Phe-[CS-NH]-Phe (100 µM, rot) fibrilliert nicht, während die minimale Verschiebung des Schwefelatoms hin zur Phe-[CS-NH]-Ala-Position (100µM, grün) zu einem Fibrillierungsverhalten ähnlich dem Oxopeptid führt. Die durchgezogenen Linien stellen eine sigmoidale Anpassung an die experimentellen Messpunkte dar.

Die spektralen und chemischen Eigenschaften der Thioxogruppe erlauben es, Untersuchungsmethoden bei der Erforschung der Fibrillierung anzuwenden, die mit den normalen oxoanalogen Aß-Spezies nicht möglich sind. Abbildung 3 zeigt an zwei Beispielen, wie die Aß-Aggregation sich dramatisch ändern kann, wenn in bestimmten Aminosäurepositionen ein Sauerstoffatom durch Schwefel ersetzt wird. Während die schwarze Kurve in Abbildung 3 das Fibrillierungsverhalten des Oxopeptides beschreibt,  zeigen die grünen und roten experimentellen Punkte eine große Abhängigkeit dieser Eigenschaft von der Schwefelposition an. Da sich in den Thioxopeptiden die Konformation der Peptide durch Bestrahlung mit Licht gezielt beeinflussen lässt, werden die Wissenschaftler die Auswirkungen der so erzeugten Konformationen auf die Fibrillierung messen können.

Literaturhinweise

1.
Striggow, F.; Schmidt, W.; Fischer, G.; Theuerkorn, M.; Malesevic, M.; Weiwad M.; Prell, E.
Compounds for the treatment of neurodegenerative disorders
Europäische Patentanmeldung, EP12183510.2 (2012)
2.
Morgado, I.; Wieligmann, K.; Bereza, M.; Rönicke, R.; Meinhardt, K.; Wacker, J.; Hortschansky, P.; Malešević, M.; Parthier C.; Schiene-Fischer, C.; Reymann, K. G.; Stubbs, M. T.; Görlach, M.; Horn, U.; Fändrich, M.
Molecular basis of β-amyloid oligomer binding and inhibition with a conformation-specific antibody fragment
Proceedings of  the National Academy of Sciences USA 109, 12503–12508 (2012)
3.
Habicht, G.; Haupt, C.; Friedrich, R. P.; Hortschansky, P.; Sachse, C.; Meinhardt, J.; Wieligmann, K.; Gellermann, G. P.; Brodhun, M.; Götz, J.; Halbhuber, K. J.; Röcken, C.; Horn, U.; Fändrich, M.
Directed selection of a conformational antibody domain that prevents mature amyloid fibril formation by stabilizing Ab protofibrils
Proceedings of  the National Academy of Sciences USA 104, 19232–19237 (2007)
4.
Haupt, C.; Morgado, I.; Kumar, S. T.; Parthier, C.; Bereza, M.; Hortschansky, P.; Stubbs, M. T.; Horn, U.; Fändrich, M.
Amyloid fibril recognition with the conformational B10 antibody fragment depends on electrostatic interactions
Journal of Molecular Biology 405, 341–348 (2011)
5.
Haupt, C.; Bereza, M.; Kumar, S. T.; Kieninger, B.; Morgado, I.; Hortschansky, P.; Fritz, G.; Röcken, C.; Horn, U.; Fändrich, M.
Pattern recognition with a fibril-specific antibody fragment reveals the surface variability of natural amyloid fibrils
Journal of Molecular Biology 408, 529–540 (2011)
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