Forschungsbericht 2013 - Max-Planck-Institut für Physik komplexer Systeme

Falten, Kanäle, Nahrung und Biofilme

Autoren
Zaburdaev, Vasily
Abteilungen

Biologische Physik

Zusammenfassung
Bei Bakterien denken wir häufig an schwimmende Zellen, aber die meisten bilden komplexe Gemeinschaften auf Oberflächen, sogenannte Biofilme. Biofilme verursachen unzählige Probleme, darunter Zahnverfall und ernsthafte Infektionen. Damit Biofilme wachsen und überleben, benötigen sie Nährstoffe; durch Diffusion allein würden sich diese in großen Biofilmen aber zu langsam verteilen. Große Organismen, wie der Mensch, besitzen daher Blutgefäße, in denen Nährstoffe schnell transportiert werden. Wir zeigen, dass in einigen Biofilmen ein ähnliches Netzwerk von Kanälen zum Nährstofftransport vorliegt.

Einleitung

Durch unser morgendliches Zähneputzen entfernen wir Zahnbelag (Plaque), was nichts anderes ist als eine Ansammlung verschiedener Bakterien auf der Zahnoberfläche. Nicht nur auf organischen, auch auf künstlichen Oberflächen ist Kolonisation durch Bakterien ein häufiges Problem. Dies begründet beispielsweise die Notwendigkeit Katheter bei Patienten regelmäßig zu ersetzen. Dies sind zwei Beispiele für durch Biofilme verursachte Probleme – weitere Beispiele sind Krankenhausinfektionen, Biofouling oder Verunreinigung medizinischer Geräte. In anderen Zusammenhängen können Biofilme sehr nützlich sein, etwa bei der Abwasseraufbereitung, im Pflanzenschutz oder in mikrobiellen Brennstoffzellen. Biofilme sind dichte, multizelluläre Gemeinschaften von Bakterien, die von einer selbstproduzierten extrazellulären Polymer-Matrix umgeben sind und sich auf Oberflächen bilden [1, 2]. Sie sind mechanisch robust und überleben oftmals die 1000-fache Dosis einer Antibiotikabehandlung, die bereits ausreichen würde, um frei lebende Bakterien abzutöten [3, 4]. Das Wachstum und die Physiologie eines Biofilms ist auf den Transport von in Wasser gelösten Nährstoffen, Abfallprodukten und Signalmolekülen angewiesen. Neueste Laboruntersuchung zeigen nun einen möglichen Mechanismus auf, durch den der Nährstofftransport bewerkstelligt wird: Bakterienkolonien bilden ein Netzwerk von Kanälen aus, das Flüssigkeitstransport durch den Biofilm ermöglicht. Treibende Kraft der Flüssigkeitsströmung durch diese Kanäle ist die Verdunstung von Wasser an der Oberfläche des Biofilms.

Bacillus subtilis Biofilme und die Hypothese von Kanälen im Biofilm

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Original 1508156484
Abb. 1: Foto eines vollentwickelten Biofilms von B. subtilis, der auf nährstoffreichem Agargel gezüchtet ist. Der Durchmesser der Kolonie beträgt etwa 2 cm. Die makroskopischen Falten auf der Biofilmoberfläche entsprechen einem Netzwerk von mit Wasser gefüllten Kanälen, die den Transport von Nährstoffen zu Bakterien im Biofilm unterstützen.
Abb. 1: Foto eines vollentwickelten Biofilms von B. subtilis, der auf nährstoffreichem Agargel gezüchtet ist. Der Durchmesser der Kolonie beträgt etwa 2 cm. Die makroskopischen Falten auf der Biofilmoberfläche entsprechen einem Netzwerk von mit Wasser gefüllten Kanälen, die den Transport von Nährstoffen zu Bakterien im Biofilm unterstützen.

Bacillus subtilis ist ein Modellbakterium für Studien zur Biofilmentstehung und wird im Labor gewöhnlich auf der Oberfläche von wasser- und nährstoffhaltigen Agarplatten gezüchtet [5]. Dem Agargel wird anfänglich ein flüssiger Tropfen eingeimpft, der planktonische Bakterien enthält. Durch Wachstum und Zellteilung der Bakterien nimmt die Höhe des Biofilms bis zu einer Dicke von einigen hundert Mikrometern zu. Das vertikale Wachstum wird dabei stark verlangsamt, da diffundierende Nährstoffe die Zellen an der Oberfläche des Biofilms nicht erreichen können. Biofilme von B. subtilis erhalten mehr Nährstoffe, indem sie sich horizontal ausbreiten [6]. Wenn sich die Bakterienkolonie ausbreitet, wird der Großteil der Nährstoffe dennoch von Zellen am Rand der Kolonie verbraucht, weshalb den Bakterien im Inneren des Biofilms zu wenige Nährstoffe bereitstehen. Dies lässt vermuten, dass Biofilme von B. subtilis als Reaktion auf Nährstoffknappheit Mechanismen entwickelt haben, um den Transport von Nährstoffen zu unterstützen und zu erhöhen. Die Architektur eines auf Agar gezüchteten, vollentwickelten Biofilms von Wildtyp-Bakterien B. subtilis weist eine charakteristische faltige Struktur auf und enthält ein komplexes Netzwerk von verästelten Falten an der Oberfläche des Biofilms (siehe Abb. 1). Die Form dieser Falten im Biofilm erinnert an eine aus der Ebene hervortretende dünne Folie und weist auf mögliche kanalartige Strukturen innerhalb des Biofilms hin. Diese Strukturen könnten die Strömung von Flüssigkeiten beeinflussen und dadurch die Nährstoffversorgung im Biofilm verbessern.

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Original 1508156483
Abb. 2: Das verästelte Netzwerk von Kanälen in einem B. subtilis Biofilm. In der Mitte des Biofilms wurde eine Mischung kleiner, fluoreszierender Kügelchen injiziert, die sich unter den Falten der Bakterienkolonie ausbreiteten.
Abb. 2: Das verästelte Netzwerk von Kanälen in einem B. subtilis Biofilm. In der Mitte des Biofilms wurde eine Mischung kleiner, fluoreszierender Kügelchen injiziert, die sich unter den Falten der Bakterienkolonie ausbreiteten.

Eine Möglichkeit, die Bedeutung der Falten für Flüssigkeitsströmungen zu untersuchen, besteht in konfokalen Mikroskopaufnahmen eines B. subtilis Biofilms. Wird Wasser mit einem fluoreszierenden Farbstoff in verschiedene Regionen des Biofilms injiziert, zeigt sich, dass flache Regionen des Biofilms einen hohen Widerstand gegenüber Strömungen aufweisen. Wird Flüssigkeit dagegen in eine Falte injiziert, strömt die wässrige Lösung schnell in Gebiete unterhalb der Falte und folgt einem komplexen Netzwerk von Kanälen, die einen geringen Widerstand gegenüber Strömungen haben. Wird die wässrige Lösung in eine Falte nahe der Mitte des Biofilms injiziert, lässt sich die Konnektivität dieses Netzwerks von Kanälen studieren: Das resultierende Bild des Kanalnetzwerks zeigt, dass die Kanäle vielfältig miteinander verbunden sind (siehe Abb. 2).

Bemerkenswerterweise ist der Druck innerhalb der Kanäle relativ zum Atmosphärendruck reduziert. Wird eine konische Glaskapillare, die teilweise mit Flüssigkeit gefüllt ist, in eine Falte eingeführt, verteilt sich die Flüssigkeit sofort in den Kanal. Dabei übersteigt der Druckabfall innerhalb des Kanals den Kapillardruck, der mit dem Flüssigkeit-Luft-Meniskus in der Glaskapillare zusammenhängt. Eine präzise Druckmessung innerhalb des Kanalnetzwerks kann an B. subtilis Biofilmen vorgenommen werden, deren Kanäle an einem Ende offen sind und einen Meniskus an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche haben. Über mehrere Messungen des Meniskus kann der mittlere Krümmungsradius ermittelt und somit ein mittlerer Druckabfall von ΔPc≈0,9 kPa abgeschätzt werden.

Der Wasserdruck im Biofilm wird auch reduziert, falls eine Verdunstung von der Biofilmoberfläche stattfindet. Dies muss immer dann der Fall sein, wenn der Biofilm der Luft ausgesetzt ist, wo der umgebende Dampfdruck des Wassers geringer ist als der gesättigte Dampfdruck des Wassers. Die Verdunstung erzeugt an der Oberfläche des Biofilms den Druckabfall, der benötigt wird, um eine Wasserströmung vom Agar hinauf und durch den Biofilm anzutreiben (siehe Abb. 3). Die Bedeutung der Verdunstung für den sich einstellenden Druck im Kanal wird bestätigt, wenn man die Verdunstung unterbindet, indem man den Biofilm mit einem Gefäß bedeckt und den Dampfdruck des umgebenden Wassers sättigen lässt. Anschließend wird ein Tropfen Silikonöl mit fluoreszierendem Farbstoff am Ende eines offenen Kanals platziert, das dem Tropfen erlaubt den Meniskus zu befeuchten; erstaunlicherweise bleibt er jedoch außerhalb des Biofilms. Sobald der Gefäßdeckel geöffnet wird und die Verdunstung wieder einsetzt, wird das Öl auch in den Kanal gezogen und wandert bis tief hinein in den Biofilm. Dieses Ergebnis zeigt eindeutig, dass der reduzierte Druck in den Kanälen primär vom Verdunstungsfluss stammt.

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Original 1508156483
Abb. 3: Illustration der Verdunstung von Wasser als der treibenden Kraft für Strömungen im Biofilm. Wasser wird vom Agargel durch den Biofilm gepumpt und verdampft an dessen Oberfläche. Strömungen in der Ebene des Biofilms gibt es aufgrund einer nicht-gleichförmigen Verdampfung. Der Inset zeigt den Querschnitt eines mit Wasser gefüllten Kanals.
Abb. 3: Illustration der Verdunstung von Wasser als der treibenden Kraft für Strömungen im Biofilm. Wasser wird vom Agargel durch den Biofilm gepumpt und verdampft an dessen Oberfläche. Strömungen in der Ebene des Biofilms gibt es aufgrund einer nicht-gleichförmigen Verdampfung. Der Inset zeigt den Querschnitt eines mit Wasser gefüllten Kanals.

Um die durch Verdunstung induzierte Wasserströmung weiter zu untersuchen, kann die Temperaturverteilung auf der Oberfläche in der Nähe des Biofilms mithilfe einer Infrarot-Kamera erfasst werden. Jede lokale Verringerung der Oberflächentemperatur relativ zur Umgebung stammt höchstwahrscheinlich von der Verdunstungskühlung. Auf der Oberfläche gibt es eindeutig einen Temperaturgradienten, vom Agar in Richtung des Biofilms, und auf der Oberfläche des Biofilms findet sich sogar eine noch geringere Temperatur. Dies ist konsistent mit der Strömung von Wasser vom Agar in den Biofilm. Darüber hinaus gibt es in der Verdunstungsrate Heterogenitäten entlang der Oberfläche des Biofilms; insbesondere ist die Verdunstung an der Oberfläche der Falten am stärksten. Die räumlichen Unterschiede im Verdampfungsfluss resultieren aus der lokalen Oberflächenkrümmung aufgrund der Falten.

Die Strömung von Flüssigkeit in den Kanälen unterstützt den Transport von Nährstoffen und sollte daher das Wachstum beschleunigen. Um diese Vorhersage zu testen, misst man während des Wachstums die gesamte Biomasse eines vollentwickelten Biofilms als Funktion des Verdampfungsflusses. Die Verdampfungsrate während des Biofilmwachstums lässt sich durch die relative Feuchtigkeit (rF) einstellen. Wie erwartet steigt die Verdampfungsrate proportional zur relativen Feuchtigkeit. Wenn nach zweieinhalb Tagen Wachstum bei konstanter rF die gesamte trockene Biomasse pro Bakterienkolonie gemessen wird, stellt man fest, dass die mittlere Biomasse einer Kolonie linear mit der Verdampfungsrate ansteigt.

Schlussfolgerungen

Das Vorhandensein eines ausgedehnten Netzwerks von mit Flüssigkeit gefüllten Kanälen in B. subtilis Biofilmen legt nahe, dass diese wohldefinierten Strukturen mit hoher Permeabilität für Strömungen den Flüssigkeitstransport erhöhen [7]. Obwohl Verdampfung eine treibende Kraft für die Flüssigkeitsströmung ist, könnten planktonische Bakterien oder Gradienten im osmotischen Druck ebenfalls Strömungen verursachen. Ein besseres Verständnis für die physikalischen Mechanismen des Fluidtransports in bakteriellen Biofilmen ist grundlegend für das Verstehen der Biofilmentwicklung und kann Einsichten in Prävention und Kontrolle von Biofilmwachstum liefern. Die besondere Bedeutung des Kanalnetzwerks müssen in neue künftige Beschreibungen des Flüssigkeitstransports in Biofilmen einbezogen werden.

Literaturhinweise

1.
O’Toole, G.; Kaplan, H. B.; Kolter, R.
Biofilm formation as microbial development
Annual Review of Microbiology 54, 49-79 (2000)
2.
Costerton, J. W.; Stewart, P. S.; Greenberg, E. P.
Bacterial Biofilms: A common cause of persistent infections
Science 284, 1318-1322 (1999)
3.
Bryers, J. D.
Medical biofilms
Biotechnology and Bioengineering 100, 1-18 (2008)
4.
Costerton, J. W.; Cheng, K.-l.; Geesey, G. G.; Ladd, T. I.; Nickel, J. C.; Dasgupta, M.; Marrie, T. J.
Bacterial biofilms in nature and disease
Annual Review of Microbiology 41, 435-464 (1987)
5.
Aguilar, C.; Vlamakis, H.; Losick, R.; Kolter, R.
Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism
Current Opinion in Microbiology 10, 638-643 (2007)
6.
Seminara, A.; Angelini, T. E.; Wilking, J.,N.; Vlamakis, H.; Ebrahim, S.; Kolter, R.; Weitz, D. A.; Brenner, M. P.
Osmotic spreading of Bacillus subtilis biofilms driven by an extracellular matrix
Proceedings of the National Academy of Sciences USA 109, 1116-1121 (2012)
7.
Wilking, J. N.; Zaburdaev, V.; De Volder, M.; Losick, R.; Brenner, M. P.; Weitz, D. A.
Liquid transport facilitated by channels in Bacilus subtilis biofilms
Proceedings of the National Academy of Sciences USA 110, 848–852 (2013)
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