Forschungsbericht 2010 - Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie

Etablierung der kompatiblen Interaktion von Ustilago maydis mit seiner Wirtspflanze Mais

Autoren
Döhlemann, Gunther
Abteilungen

Organismische Interaktionen (Kahmann) (Prof. Dr. Regine Kahmann)
MPI für terrestrische Mikrobiologie, Marburg

Zusammenfassung
Der Brandpilz Ustilago maydis ist Verursacher des Maisbeulenbrandes. Nach Infektion unterdrückt der Pilz die Abwehr der Pflanze, was die biotrophe Entwicklung des Pilzes ermöglicht. In Abwesenheit des von U. maydis sekretierten Effektorproteins Pep1 bleibt diese Unterdrückung der Pflanzenabwehr allerdings aus; die Infektion wird erfolgreich abgewehrt. Pep1 stellt demnach einen entscheidenden Faktor für die Kompatibilität zwischen Wirt und Pathogen dar. Die Aufklärung der Pep1-Funktion wird grundlegend zum besseren Verständnis von biotrophen Pilz-Pflanze- Interaktionen beitragen.

Einleitung

Die Brandpilze (Ustilaginomycotina) sind eine mehr als 1200 Arten umfassende Gruppe von pflanzenpathogenen Pilzen, die zahlreiche Getreidearten befällt, darunter Weizen, Mais, Gerste und Hafer. Der Brandpilz Ustilago maydis parasitiert auf Mais (Zea mays) sowie dessen Urform Teosinthe (Zea mays ssp. parviglumis) und ist der Verursacher des Maisbeulenbrandes. Dank seiner einfachen Kultivierbarkeit, des kurzen Infektionszyklus von zirka zwei Wochen sowie der hervorragenden Zugänglichkeit für molekulargenetische Techniken, wurde U. maydis in den letzten Jahren als Modellsystem sowohl für zellbiologische als auch pathogenitäts-relevante Fragestellungen etabliert. Seit 2006 ist auch die komplette Genomsequenz von U. maydis bekannt und öffentlich verfügbar [1].

Die Infektion der Wirtspflanze Mais beginnt mit der direkten Penetration der Epidermis. Dabei werden spezielle Infektionsstrukturen, die so genannten Appressorien, ausgebildet (Abb. 1A). Die penetrierende Hyphe dringt in die Wirtszelle ein, wo sie allerdings von der unverletzt bleibenden Plasmamembran der Pflanzenzelle umhüllt bleibt (Abb. 1B). In dieser biotrophen Interaktion bleiben die infizierten Pflanzenzellen während des gesamten Infektionszyklus am leben und ernähren die wachsenden Pilzzellen. Im weiteren Verlauf der Infektion kommt es zur massiven Proliferation der Pilzhyphen in den Zellzwischenräumen (Abb. 1C; [2]) und schließlich zur Ausbildung von Pflanzentumoren (Abb. 1D), in denen der Pilz seinen Lebenszyklus durch die Bildung der so genannten Teliosporen abschließt [3].

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Original 1508155059
Pathogene Entwicklung von Ustilago maydis auf seiner Wirtspflanze Mais. A Etwa 12 Stunden nach Infektion beginnt die Ausbildung von Appressorien (roter Pfeil) auf der Blattoberfläche (Balken: 10 µm). B Während der frühen biotrophen Phase, 1-4 Tage nach Infektion, wächst U. maydis intrazellulär (Pilzhyphen mittels green fluorescent protein (GFP) grün markiert) und ist dabei kontinuierlich von der Plasmamembran der Wirtszellen umgeben (rot, gefärbt mit FM4-64; Balken: 5 µm). C Während der Tumorbildung, 6-12 Tage nach Infektion, bilden sich umgeben von deutlich vergrößerten Wirtszellen zunehmend größer werdende Aggregate von Pilzzellen, in denen schließlich die Bildung der Teliosporen stattfindet (grün: U. maydis Hyphen, gefärbt mit WGA-AF488; blau: Autofluoreszenz der pflanzlichen Zellwände; Balken: 50 µm). D Im Freiland kommt es meist zur stärksten Symptomausprägung im Blütengewebe, hier in einem Maiskolben, der vollständig zu Tumorgewebe transformiert ist.
Pathogene Entwicklung von Ustilago maydis auf seiner Wirtspflanze Mais. A Etwa 12 Stunden nach Infektion beginnt die Ausbildung von Appressorien (roter Pfeil) auf der Blattoberfläche (Balken: 10 µm). B Während der frühen biotrophen Phase, 1-4 Tage nach Infektion, wächst U. maydis intrazellulär (Pilzhyphen mittels green fluorescent protein (GFP) grün markiert) und ist dabei kontinuierlich von der Plasmamembran der Wirtszellen umgeben (rot, gefärbt mit FM4-64; Balken: 5 µm). C Während der Tumorbildung, 6-12 Tage nach Infektion, bilden sich umgeben von deutlich vergrößerten Wirtszellen zunehmend größer werdende Aggregate von Pilzzellen, in denen schließlich die Bildung der Teliosporen stattfindet (grün: U. maydis Hyphen, gefärbt mit WGA-AF488; blau: Autofluoreszenz der pflanzlichen Zellwände; Balken: 50 µm). D Im Freiland kommt es meist zur stärksten Symptomausprägung im Blütengewebe, hier in einem Maiskolben, der vollständig zu Tumorgewebe transformiert ist.

Unterdrückung der pflanzlichen Abwehr durch U. maydis

Frühe Symptome einer U. maydis Infektion sind Chlorosen der Blattoberfläche und, in seltenen Fällen, kleine nekrotische Bereiche am Ort der Infektion. In dieser Phase der Interaktion weisen U. maydis – Hyphen polares Spitzenwachstum auf und bewegen ihr gesamtes Cytoplasma zur Hyphenspitze. Ältere Hyphenabschnitte erscheinen dabei leer und werden durch Septen abgetrennt [4]. Pflanzenzellen, die solche kollabierten Hyphen enthalten, reagieren oft mit programmiertem Zelltod als Abwehrmaßnahme gegen den Pilz. In einer späteren Infektionsphase induziert U. maydis die Bildung von Tumoren durch Vergrößerung und Proliferation der Pflanzenzellen. In diesen Tumoren aggregieren pilzliche Zellen, ohne Zelltod im umgebenden pflanzlichen Gewebe auszulösen [2, 5].

Untersuchungen der transkriptionellen Antwort von Mais auf eine Infektion durch U. maydis mit dem Affymetrix© Microarray-System zeigten eine frühzeitige Erkennung des Pilzes auf der Blattoberfläche, die eine starke, unspezifische Pflanzenabwehrreaktion zur Folge hat. Mit Etablierung der biotrophen Interaktion zirka 24 Stunden nach der Infektion nimmt diese Abwehrreaktion wieder ab [5]. Gleichzeitig werden in der Pflanze Gene für die Zelltod-Unterdrückung induziert, wie beispielsweise der Bax-Inhibitor-1 [6]. Diese Befunde legen nahe, dass U. maydis nach erfolgreicher Etablierung der biotrophen Interaktion die Pflanzenabwehr, insbesondere den programmierten Zelltod, aktiv unterdrücken kann und damit die Ausbildung einer kompatiblen Interaktion mit der Wirtspflanze ermöglicht.

Das Effektorprotein Pep1

Um den pflanzlichen Abwehrreaktionen entgegenzuwirken, sekretieren mikrobielle Pathogene eine Vielzahl von Proteinen, so genannte Effektoren, welche in die Pflanzenabwehr eingreifen und so die erfolgreiche Infektion ermöglichen [7]. Mikrobielle Effektorproteine weisen eine hohe strukturelle und funktionelle Vielfalt auf. Oftmals handelt es sich um Proteine ohne konservierte funktionelle Domänen, die meist keinerlei Ähnlichkeit zu bereits bekannten Proteinen haben.

Das Genom von U. maydis kodiert 386 putativ sekretierte Proteine, denen gemäß ihrer Aminosäuresequenz keine enzymatische Funktion zugeschrieben werden kann. Interessanterweise sind viele der Gene, die solche potenzielle Effektoren kodieren, in Genclustern arrangiert – sie liegen also in räumlicher Nähe zueinander [1]. U. maydis Mutanten, in denen diese Gencluster gezielt ausgeschaltet wurden, zeigten verschiedene Defekte während der pathogenen Entwicklung, waren jedoch sämtlich zur erfolgreichen Besiedelung der penetrierten Wirtszelle fähig [1]. Dies führte zu der Vermutung, dass es weitere Effektoren außerhalb der beschriebenen Gencluster geben müsse, die initial die Etablierung der kompatiblen Interaktion und somit auch die beobachtete Suppression der pflanzlichen Abwehrreaktion vermitteln.

Eine systematische Analyse von mutmaßlichen Effektorgenen in U. maydis führte schließlich zur Identifikation des neuartigen Effektorproteins Pep1 (protein essential during penetration 1). Deletionsmutanten von Pep1 weisen einen völligen Verlust der Tumorbildung in infizierten Maispflanzen auf. Auch für einen weiteren Brandpilz, den Erreger des Gerstenhartbrandes (Ustilago hordei) ist Pep1 ein essenzieller Pathogenitätsfaktor [6]. Mittels konfokaler Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass Pep1-Deletionsmutanten im Gegensatz zum Wildtyp 24 Stunden nach Infektion die pflanzliche Plasmamembran invaginieren, jedoch nicht zur weiteren Besiedelung des Wirtsgewebes in der Lage sind [8]. Um das Pep1-Protein im Pflanzengewebe zu lokalisieren, wurden fluoreszenzmarkierte Versionen des Proteins genutzt. GFP- (green fluorescent protein) markiertes Pep1 wird demnach von intrazellulär wachsenden U. maydis Zellen sekretiert und akkumuliert an den Hyphenspitzen, vor allem während der Zell-Zell-Passagen (Abb. 2). Zudem konnte gezeigt werden, dass sich Pep1 an der Schnittstelle zwischen Pilzhyphe und Wirtszelle, der so genannten biotrophen Interaktionszone, befindet [8].

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Original 1508155060
In vivo Lokalisierung von Pep1-GFP innerhalb des Wirtsgewebes. Pep1-GFP (grün) akkumuliert während der Zell-Zell-Penetration um eine Hyphenspitze herum (Pfeilspitze). Membranstrukturen (rot) wurden mit dem Farbstoff FM4-64 sichtbar gemacht. Balken: 5µm.
In vivo Lokalisierung von Pep1-GFP innerhalb des Wirtsgewebes. Pep1-GFP (grün) akkumuliert während der Zell-Zell-Penetration um eine Hyphenspitze herum (Pfeilspitze). Membranstrukturen (rot) wurden mit dem Farbstoff FM4-64 sichtbar gemacht. Balken: 5µm.

Der Verlust der Pathogenität der Pep1-Mutante geht einher mit makroskopischen Symptomen: dem Absterben infizierter Blattbereiche, einer erhöhten Autofluoreszenz der Zellwand sowie der Akkumulation von Wasserstoffperoxid um die Appressorien herum [8]. Microarray- Analysen von Maispflanzen 24 Stunden nach Infektion mit Δpep1-Mutanten zeigten zudem, dass es im Gegensatz zur Interaktion mit dem Wildtyp nicht zu einer Reprimierung der Pflanzenabwehr kommt. Die Antwort der Pflanze auf eine Infektion durch Δpep1-Mutanten ist somit typisch für eine Nicht-Wirts-Antwort, also für eine Interaktion mit einem Pathogen, das nicht auf eine erfolgreiche Besiedelung von Mais adaptiert ist. Oder mit anderen Worten: Die Sekretion von Pep1 in die biotrophe Interaktionszone ist eine essenzielle Voraussetzung für die Etablierung einer erfolgreichen Interaktion zwischen Ustilago maydis und seiner Wirtspflanze, dem Mais. Bisher unbekannt ist allerdings, wie Pep1 in der Pflanze funktioniert. Denkbar wäre beispielsweise, dass Pep1 grundlegende Komponenten der pflanzlichen Abwehr inhibiert, aber auch weitere Erklärungsmodelle erscheinen plausibel (Abb. 3).

Da es sich bei Pep1 offenbar um einen grundlegenden Faktor für die Pathogenität von Brandpilzen handelt, ist es von größtem Interesse, die Funktionsweise von Pep1 auf molekularer Ebene zu verstehen. Das umfassende Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Interaktion von pathogenen Pilzen mit ihren Wirtspflanzen zu Grunde liegen, ist dabei nicht allein von wissenschaftlicher Relevanz. In Anbetracht der weltweiten, jährlich wiederkehrenden Ernteausfälle durch Schadpilze und des stetig steigenden Einsatzes von Umwelt und den Menschen gefährdenden Fungiziden besteht die dringende Aufgabe, dieses Wissen für die Züchtung stabiler Resistenzen gegen Schadpilze in Getreidepflanzen zu nutzen.

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Original 1508155060
Modell zur Darstellung möglicher Funktionsmechanismen von Pep1. 1 Pep1 akkumuliert um biotroph wachsende Hyphenspitzen herum und könnte so eine abschirmende Funktion haben, um die Pilzzelle vor pflanzlichen Enzymen zu schützen. 2 Pep1 könnte mit anderen Pilz-Effektoren interagieren und diese dadurch aktivieren. 3 Pep1 könnte als Inhibitor für Pathogen-induzierte Pflanzenenzyme, beispielsweise Proteasen, fungieren. 4 Die Akkumulation von Wasserstoffperoxid an Hyphenspitzen von U. maydis bei Abwesenheit von Pep1 könnte auf eine Inhibierung der NADPH-Oxidase oder weiterer Produzenten von Sauerstoffradikalen hinweisen. 5 Um die Etablierung einer kompatiblen Interaktion zu ermöglichen, bewirkt U. maydis eine Suppression der Pflanzenabwehr. Dass dies in Abwesenheit von Pep1 nicht geschieht, könnte auf die Blockierung eines pflanzlichen Rezeptorproteins hindeuten.
Modell zur Darstellung möglicher Funktionsmechanismen von Pep1. 1 Pep1 akkumuliert um biotroph wachsende Hyphenspitzen herum und könnte so eine abschirmende Funktion haben, um die Pilzzelle vor pflanzlichen Enzymen zu schützen. 2 Pep1 könnte mit anderen Pilz-Effektoren interagieren und diese dadurch aktivieren. 3 Pep1 könnte als Inhibitor für Pathogen-induzierte Pflanzenenzyme, beispielsweise Proteasen, fungieren. 4 Die Akkumulation von Wasserstoffperoxid an Hyphenspitzen von U. maydis bei Abwesenheit von Pep1 könnte auf eine Inhibierung der NADPH-Oxidase oder weiterer Produzenten von Sauerstoffradikalen hinweisen. 5 Um die Etablierung einer kompatiblen Interaktion zu ermöglichen, bewirkt U. maydis eine Suppression der Pflanzenabwehr. Dass dies in Abwesenheit von Pep1 nicht geschieht, könnte auf die Blockierung eines pflanzlichen Rezeptorproteins hindeuten.

Originalveröffentlichungen

1.
F. Banuett, I. Herskowitz:
Discrete developmental stages during teliospore formation in the corn smut fungus, Ustilago maydis.
Development 122, 2965 - 2976 (1996).
2.
G. Doehlemann, R. Wahl, M. Vranes, R. P. de Vries, J. Kämper, R. Kahmann:
Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.
Journal of Plant Physiology 165, 29 - 40 (2008).
3.
G. Doehlemann, R. Wahl, R. J. Horst, L. M. Voll, B. Usadel, F. Poree, M. Stitt, J. Pons-Kühnemann, U. Sonnewald, R. Kahmann, J. Kämper:
Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.
The Plant Journal 56, 181 - 195 (2008).
4.
G. Doehlemann, K. van der Linde, D. Assmann, D. Schwammbach, A. Hof, A. Mohanty, D. Jackson, R. Kahmann:
Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis, is required for successful invasion of plant cells.
PLoS Pathogens 5, e1000290 (2009). DOI:10.1371/journal.ppat.1000290.
5.
R. Eichmann, H. Schultheiss, K. H. Kogel, R. Hückelhoven:
The barley apoptosis suppressor homologue BAX inhibitor-1 compromises nonhost penetration resistance of barley to the inappropriate pathogen Blumeria graminis f. sp. tritici.
Molecular Plant Microbe Interactions 17, 484 - 490 (2004).
6.
J. D. Jones, J. L. Dangl:
The plant immune system.
Nature 444, 323 - 329 (2006).
7.
J. Kämper, R. Kahmann, M. Bölker, L. J. Ma, T. Brefort et mult. al.:
Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.
Nature 444, 97 - 101 (2006).
8.
K. M. Snetselaar, C. W. Mims:
Light and electron microscopy of Ustilago maydis hyphae in maize.
Mycological Research 98, 347 - 355 (1994).
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