Forschungsbericht 2010 - Max-Planck-Arbeitsgruppen für strukturelle Molekularbiologie am DESY

Ein Enzym mit enger Verwandtschaft zu humanen Monoaminoxidasen ermöglicht Bodenbakterium ein Leben von Nikotin

Autoren
Bartunik, Hans D.
Abteilungen

Proteindynamik (Dr. Hans-Dieter Bartunik)
MP Arbeitsgruppen für strukturelle Molekularbiologie am DESY, Hamburg

Zusammenfassung
Das Bodenbakterium Arthrobacter nicotinovorans „ernährt“ sich von Nikotin. Der Abbau von L-Nikotin und D-Nikotin erfolgt durch zwei genetisch nicht verwandte Flavoenzyme, 6HLNO und 6HDNO. Ihre Kristallstrukturen bieten eine Erklärung für die Stereospezifizität der Enzymkatalyse. 6HLNO zeigt in Struktur und Funktionsweise enge Verwandtschaft zu humanen Monoaminoxidasen (MAO), die eine zentrale Rolle beim Abbau von Neurotransmittern spielen. Die Strukturanalyse von 6HLNO-Reaktionsintermediaten und des Inhibitionsmechanismus erweitert die Grundlagen für eine mögliche Entwicklung neuer MAO-Wirkstoffe.

Nikotinabbau durch zwei verschiedene Enzyme mit spiegelbildlicher Reaktionsweise

Nikotin, das in Tabakpflanzen nahezu vollständig in der (linksdrehenden) L-Form vorliegt und als Insektizid fungiert, dient einer Reihe von Bakterienarten als alleinige Nahrungsquelle, um aus dem Abbau des Alkaloids ihren Bedarf an Kohlenstoff und Stickstoff zu decken [1]. Im Bodenbakterium Arthrobacter nicotinovorans beginnt der Nikotinabbau mit der Hydroxylierung des Pyridinrings an C6. Im darauf folgenden Schritt, der für L-Nikotin durch 6-Hydroxy-L-Nikotin-Oxidase (6HLNO) und für D-Nikotin durch 6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase (6HDNO) katalysiert wird, wird der Pyrrolidinring zum Myosmin-Intermediat oxidiert. Anschließende Ringöffnung durch Hydrolyse führt zum Produkt 6-Hydroxy-Pseudooxynikotin (Abb. 1). Im menschlichen Körper, der Nikotin (auch) durch Passivrauchen und in vergleichbarer Menge durch Nahrung (bestimmte Gemüse, Tee) aufnimmt, beginnt der Abbau von Nikotin zu einem hohen Prozentsatz mit einem direkten Angriff auf den Pyrrolidinring, dessen Oxidation durch die Enzyme Cytochrom-P450 und Aldehydoxidase zur Bildung von Cotinin führen [2].

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Original 1293749388
Nikotinabbau durch Arthrobacter nicotinovorans.
Nikotinabbau durch Arthrobacter nicotinovorans.

6HLNO und 6HDNO sind Flavoenzyme, die mithilfe von FAD-Kofaktoren ein und dieselbe Reaktion an den stereomeren Substraten katalysieren. Die beiden Enzyme weisen jedoch völlig verschiedene Sequenzen und Konformationen auf. Die Kristallstrukturanalyse von 6HLNO im Komplex mit 6-Hydroxy-L-Nikotin (Abb. 2) zeigt das L-Substrat in einer Orientierung relativ zum Isoalloxazinring des Kofaktors, die Hydridtransfer vom Pyrrolidin-Kohlenstoffatom C2’, dem chiralen Zentrum, zum FAD als ersten Reaktionsschritt ermöglicht [3]. Auf der experimentellen Grundlage dieser Komplexstruktur und der Struktur des freien 6HDNO [4] wurde ein Modell der Substratbindung an 6HDNO entwickelt, das – bis auf eine Spiegelung an der Ebene des Isoalloxazinrings –eine identische Orientierung des D-Substrats relativ zum Kofaktor zeigt. Arthrobacter nicotinovorans setzt also zwei genetisch nicht verwandte Proteine mit unterschiedlicher Gesamtstruktur und chemisch induzierter Symmetriebeziehung in der Orientierung der spiegelbildlichen Substrate zum Flavinring des Kofaktors ein, um absolute Stereospezifizität der Katalyse zu erreichen. In weiteren Experimenten gelang es unter Einsatz von Tieftemperaturverfahren, den gesamten Verlauf der Enzymreaktion in 6HLNO-Kristallen vom Andocken des Substrats an die aktive Stelle (Michaelis-Zustand) über das Myosmin-Intermediat bis zur Bildung des Keton-Produkts Pseudooxynikotin in einer Serie von Kristallstrukturen hoher Auflösung zu verfolgen. In Verbindung mit früheren NMR-Messungen wurde damit eine experimentelle Grundlage zur Aufklärung des vollständigen Strukturmechanismus einer Flavooxidase auf molekularer Ebene geschaffen.

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Original 1293750213
Kristallstruktur der 6-Hydroxy-L-Nikotin-Oxidase im Komplex mit dem Substrat L-Nikotin. Die Abbildung zeigt eine Untereinheit des homodimeren Enzyms, das aus der FAD-bindenden Domäne (cyan) und der Substrat-bindenden Domäne mit zwei Unterdomänen (S1: rot; S2: lachsfarben) aufgebaut ist. Das Substrat (grün) bindet an das aktive Zentrum an der Re-Seite des FAD-Kofaktors (gelb). Die Funktion eines an S1 gebundenen Phospholipids (grau) ist noch unbekannt.
Kristallstruktur der 6-Hydroxy-L-Nikotin-Oxidase im Komplex mit dem Substrat L-Nikotin. Die Abbildung zeigt eine Untereinheit des homodimeren Enzyms, das aus der FAD-bindenden Domäne (cyan) und der Substrat-bindenden Domäne mit zwei Unterdomänen (S1: rot; S2: lachsfarben) aufgebaut ist. Das Substrat (grün) bindet an das aktive Zentrum an der Re-Seite des FAD-Kofaktors (gelb). Die Funktion eines an S1 gebundenen Phospholipids (grau) ist noch unbekannt.

Enge Verwandtschaft von 6HLNO mit MAO-A und MAO-B

Die Aufklärung der Kristallstruktur von 6HLNO [3] zeigte eine enge Verwandtschaft zu einem Humanenzym auf, das am Nikotinabbau nicht direkt beteiligt ist, aber durch Nikotinabbauprodukte inhibiert wird und am Entstehen der Nikotinabhängigkeit beteiligt ist [5]. Dieses Enzym, die in zwei Isoformen vorliegende Monoaminoxidase (MAO-A und MAO-B), spielt eine zentrale Rolle bei der Kontrolle der Konzentration von Neurotransmittern wie Dopamin und Serotonin in der Zelle. MAO-Inhibitoren sind von Bedeutung für die Behandlung einer Reihe von neurologischen Erkrankungen, die insbesondere Parkinson, Alzheimer und mentale Störungen einschließen. MAO unterscheidet sich im dreidimensionalen Aufbau von 6HLNO im Wesentlichen durch eine zusätzliche Helix am C-terminalen Ende, die der Verankerung in der mitochondrialen Membran dient. Die aktiven Zentren weisen ähnliche Lagen und Architekturen auf. Kristallstrukturen zeigten, dass 6HLNO auch die MAO-Substrate Dopamin und Serotonin binden kann. Angesichts der engen Verwandtschaft der Struktur-Funktionsbeziehungen beider Aminoxidasen ist die Kenntnis des genauen Reaktionswegs und intermediärer Bindungsstellen im 6HLNO-Molekül von potenziellem Interesse für eine mögliche gerichtete Entwicklung von MAO-Inhibitoren.

Originalveröffentlichungen

1.
R. Brandsch:
Microbiology and biochemistry of nicotine degradation.
Applied Microbiology and Biotechnology 69, 493-498 (2006).
2.
J. Hukkanen, P. Jacob, N. L. Benowitz:
Metabolism and disposition kinetics of nicotine.
Pharmacological Reviews 57, 79-115 (2005).
3.
G. S. Kachalova, G. P. Bourenkov, T. Mengesdorf, S. Schenk, H. R. Maun, M. Burghammer, C. Riekel, K. Decker, H. D. Bartunik:
Crystal structure analysis of free and substrate-bound 6-hydroxy-L-nicotine oxidase from Arthrobacter nicotinovorans.
Journal of Molecular Biology 396(3), 785-99(2010).
4.
J. W. A. Koetter, G. E. Schulz:
Crystal structure of 6-hydroxy-D-nicotine oxidase from Arthrobacter nicotinovorans.
Journal of Molecular Biology 352, 418-428 (2005).
5.
T. P. George, A. H. Weinberger:
Monoamine oxidase inhibition for tobacco pharmacotherapy.
Clinical Pharmacology & Therapeutics 83, 619-621 (2008).
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