Forschungsbericht 2010 - Max-Planck-Institut für biologische Kybernetik

Schlaue Kontrastmittel für die funktionelle Magnetresonanztomografie

Autoren
Angelovski, Goran
Abteilungen

Neurophysiologie kognitiver Prozesse (Prof. Dr. Nikos Logothetis)
MPI für biologische Kybernetik, Tübingen

Zusammenfassung
Die Methoden der Magnetresonanztomografie (MRT) liefern wichtige Erkenntnisse für die Hirnforschung. Neben der Darstellung anatomischer Strukturen steht heute insbesondere die funktionelle Magnetresonanztomografie (fMRT) zur Verfügung, mit der es möglich ist, dem Gehirn quasi beim Arbeiten zuzusehen. Allerdings wird bei dieser Methode der unterschiedliche Sauerstoffgehalt im Blut gemessen, und sie liefert somit nur indirekt eine Aussage über die Nervenzellaktivität. "Schlaue" Kontrastmittel sollen hier einen direkten Zugang zu der tatsächlichen Nervenzellaktivität ermöglichen.

Ein Ziel der Forscher am MPI für biologische Kybernetik ist es, Einsichten in die neuronalen Mechanismen der bewussten Wahrnehmung, des Lernens, der Kategorisierung und des Erkennens zu gewinnen. Dabei spielt die funktionelle Magnetresonanztomografie (fMRT), ein nichtinvasives bildgebendes Verfahren, eine wichtige Rolle.

Wenn wir den kleinen Finger beugen oder eine Blume sehen, sind bestimmte Gehirnareale aktiv. An diesen Orten wird Energie verbraucht. Diese gelangt in Form von Sauerstoff und Zucker über die Blutgefäße zu den Nervenzellen und wird dann dort verbrannt. Dieses Ereignis nutzt die fMRT, indem sie den unterschiedlichen Sauerstoffgehalt der roten Blutkörperchen mittels des sogenannten ,BOLD'-Effektes (Blood Oxygen Level Dependency) sichtbar macht. Dabei wird von einem hohen Sauerstoffgehalt indirekt auf eine Aktivierung der Nervenzellen des jeweiligen Ortes geschlossen.

Die Spezifität und die räumlich-zeitliche Auflösung des fMRT-Signals sowie sein funktionelles Kontrast-Rausch-Verhältnis sind sowohl durch die Architektur, die Dichte und die Dynamik des Gefäßsystems deutlich eingeschränkt, da der Volumenanteil des Gefäßsystems an einem abzubildenden Volumenelement (Voxel) weniger als 3% beträgt. Die fMRT ist auch langsam (im Sekundenbereich), vergleicht man sie mit tatsächlicher neuronaler Aktivität (die in Millisekunden stattfindet). Neuronale Aktivität wiederum kann direkt bisher nur invasiv, beispielsweise mittels elektrophysiologischer Ableitung gemessen werden.

Diese Nachteile der fMRT-Messung könnten teilweise reduziert werden, sollte es gelingen, bei bildgebenden Verfahren Methoden zu entwickeln, welche von der Hämodynamik unabhängig sind. Erste Entwicklungen werden bei der optischen Bildgebung eingesetzt. Dazu gehören Techniken, die auf Membranenpotenzial, pH-Wert und Ionenindikatoren (für Ca2+, Na+, K+, Cl-, Mn2+) sowie Protein- und Neurotransmitter-Marker setzen.

Schlaue, „smarte“ Kontrastmittel (smart contrast agents, SCAs), die als Ereignis- oder Molekülmarker außerhalb des Gefäßsystems des Blutkreislaufes, beispielsweise in der zerebrospinalen Flüssigkeit, funktionieren, sollten dies auch für die fMRT ermöglichen. So könnte ein Calcium-empfindliches SCA im extrazellularen Raum am synaptischen Spalt zwischen zwei Nervenzellen auf die Aufnahme von Calcium-Ionen (Ca2+) reagieren und so die Nervenzellaktivität direkt anzeigen. Damit könnte die fMRT mit schlauen Kontrastmitteln die Spezifität zellulärer neuronaler Ableitungstechniken mit der nichtinvasiven Erfassung des gesamten Gehirns kombinieren.

Entstehung des Kontrastes bei MR-Bildern

Um ein MR-Bild zu bekommen, zum Beispiel ein anatomisches Bild vom Gehirn, braucht man einen Kontrastmechanismus, der verschiedene Teile des Gehirns voneinander trennt (z. B. graue von weißer Substanz oder von zerebrospinalen Flüssigkeiten), und einen Mechanismus, durch welchen dieser Kontrast für jedes abzubildende Volumenelement (Voxel) kalkuliert werden kann. Eine Größe für MR-Kontraste sind die sogenannten Relaxationszeiten. Der Terminus „Relaxationszeit“ bezieht sich auf den exponentiellen Rückgang der Kernspinmagnetisierung angeregter Atome nach einem Radiofrequenz-Impuls.

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Der Kontrast von MR-Bildern in der Biomedizin hängt von der richtigen Auswahl der Aufnahmeparameter ab, die das Bild unterschiedlich empfindlich („gewichtet“) gegenüber Relaxationsprozessen machen. Die üblichen anatomischen Bilder des Gehirns sind entweder T1-gewichtete Bilder, wobei sich Fett als hell und Wasser als dunkel darstellt (linkes Bild), oder T2-gewichtete Bilder, wobei hier das Wasser (insbesondere zerebrospinale Flüssigkeiten) signalintensiver, also heller dargestellt wird (rechtes Bild).

Es gibt verschiedene Arten von Relaxationsprozessen. Sie heißen T1 (gründet sich auf Spin-Gitter-Interaktionen), T2 (auf der Basis von Spin-Spin-Interaktionen) bzw. T2* (Suszeptibilitätseffekte) und spiegeln jeweils verschiedene Interaktionen der Spins mit ihrer Umgebung oder mit anderen Spins wider. So wie unterschiedliche Relaxationsraten an unterschiedlichen Stellen genutzt werden können, um anatomische Kontraste zu erzielen (siehe Abb. 1), so können auch die im Laufe der Zeit erfolgenden Veränderungen einer oder mehrerer Relaxationsraten an einer einzigen Stelle instrumentalisiert werden, um Veränderungen im physisch-chemischen Zustand bildlich darzustellen. Dieses sehr einfache Prinzip steckt in der Tat hinter dem Kontrast bei der fMRT, bei dem Veränderungen der Relaxationszeiten zwischen Test- und Kontrollepochen detektiert werden.

Was ist ein smartes Kontrastmittel?

SCAs sind Sensormoleküle, deren Relaxivität eine Funktion der Konzentration eines Ions oder eines Moleküls ist, dem sogenannten Zielion oder Zielmolekül. Die Relaxivität ist ein Maß für die Fähigkeit eines Kontrastmittels, die Relaxationszeit benachbarter Wasserprotonen zu verkürzen. Je höher die Relaxivität, desto kürzer die Protonenrelaxationszeit.

Typischerweise ist ein SCA, genau wie ein konventionelles anatomisches Kontrastmittel, ein paramagnetisches Ion, das mit organischen Molekülen verbunden ist. Paramagnetische Metallionen sind wegen ihrer ungepaarten Elektronen starke MR-Kontrastmittel. Einige von ihnen verkürzen T1, ohne T2 substanziell zu beeinflussen (z. B. Gadolinium, Gd3+). Da Gd3+ T1 am stärksten beeinflusst, wird es häufiger eingesetzt als andere Ionen. Doch wie andere Lanthanoide ist Gd3+ in seiner ursprünglichen Form hochgiftig und wird daher immer nur nach Komplexierung mit unterschiedlichen Liganden eingesetzt. Ein Beispiel dafür ist das etablierte klinische intravaskuläre Kontrastmittel Magnevist, ein Gadoliniumchelat mit Diethylentriaminpentaessigsäure (Gd-DTPA), das, wenn es injiziert wird, auf den intravaskulären Raum beschränkt bleibt und den Bildkontrast erhöht.

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Man kann sich den SCA-Komplex als eine Krabbe vorstellen. Bei niedrigen Ca2+-Konzentrationen minimieren die eingezogenen Arme den Zugang von Wasser zu dem paramagnetischen Ion (linke Abbildung). Ein Anstieg der Ca2+-Konzentration verändert die Koordination des „Arm“-Moleküls (rechte Abbildung), wodurch sich beispielsweise die Anlagerung von Wasser erhöht (der erste Parameter) und gleichzeitig dessen Relaxationszeit verkürzt wird.

Das SCA wird so synthetisiert, dass eine Konzentrationsänderung des Zielions die dreidimensionale Anordnung der Komplexes beeinflusst, was nun wiederum zumindest eine der drei fundamentalen physikalischen Eigenschaften des paramagnetischen Komplexes verändert: (a) die Zahl der Wassermoleküle, die mit dem paramagnetischen Ion koordiniert sind, (b) die Lebensdauer eines Wassermoleküls, das an das paramagnetische Ion gebunden ist, und (c) die Rotationskorrelationszeit des Komplexes. Die hier genannten Parametervariationen führen zu Veränderungen der Relaxivität. Abbildung 2 illustriert das Funktionsprinzip eines SCA.

Synthese und Evaluierung von SCAs

Im Labor von Goran Angelovski und seinem Team wurden mehrere Typen von SCA-Komplexen synthetisiert: Beispielsweise SCAs, die Phosphonatgruppen in unterschiedlichen Entfernungen vom makrozyklischen (MR-aktiven) Teil enthalten und die Veränderungen im MR-Signal zeigen, wenn der pH-Wert des Mediums von physiologisch zu leicht sauer verändert wird. Physikochemische Untersuchungen weisen darauf hin, dass bei verschiedenen pH-Werten tatsächlich Veränderungen in der Koordination zwischen der Phosphonatgruppe und dem Lanthanoidmetall auftreten [1].

Auch SCAs, die eine bemerkenswerte Empfindlichkeit gegenüber Calcium-Ionen aufweisen, konnten synthetisiert werden. Abbildung 3 zeigt das Prinzip der Kontrasterzeugung eines Ca2+-empfindlichen SCA im fMRT.

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Prinzip der Kontrasterzeugung eines Ca2+-empfindlichen SCA im fMRT. Bei Stimulierung, beispielsweise mittels einen optischen Reizes, werden die an der Verarbeitung beteiligten Nervenzellen aktiv, dabei wird Ca2+ aus dem extrazellulären Raum aufgenommen. Die Reduktion der Calciumkonzentration führt dann zu einer Änderung der Relaxationszeit der das SCA umgebenden Wasserprotonen und damit zu einem Kontrast im fMRT.

Ein monomakrozyklisches Agens, das den niedrigaffinen Calciumchelator APTRA enthält, wurde synthetisiert und analysiert. Dieses Mittel verdoppelt seine T1-Relaxivität, wenn Ca2+ vorhanden ist, im Vergleich zu einer Calcium-freien Lösung [2].

Es wurden auch mehrere bis-makrozyklische MR-Agenzien vorbereitet, die an verschiedene synthetisch modifizierte Calciumchelatoren (BAPTA, EDTA, DTPA, EGTA) gekoppelt wurden, um auf extrazelluläre Calciumkonzentrationen zu zielen [3, 4]. Dies führte zu einem modifizierten, EGTA enthaltenden Agens, dessen physikochemische Eigenschaften viel besser sind als die eines jeden anderen momentan erhältlichen Calcium-sensitiven SCA. Hinzu kommt, dass die Relaxivitätsreaktionen dieser Agenzien in biologisch relevanter Umgebung wie etwa in zerebrospinaler Flüssigkeit (CSF) und in der extrazellulären Matrix (ECM) den Schluss nahe legen, dass diese Komplexe geeignete SCAs zur Detektion neuronaler Aktivität sein könnten [5]. Zurzeit werden entsprechende In-vivo-Tests durchgeführt.

Aktuelle Synthesen und In-vitro-Tests beruhen auf weiteren, neuen Gd3+- Komplexen und Verbindungen auf Basis des Liganden DO3A (1,4,7-Tricarboxymethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan), welche sich gegenüber Veränderungen im Calciumfluss, im pH-Wert oder der Konzentrationen an Neurotransmittern und Neuromodulatoren sensitiv zeigen.

Um die SCA-signalisierte Aktivität zu kartieren, wird mit Kombinationen von T2-, T2*- und T1-gewichteten Mess-Sequenzen, sog. Echo-Planar-Imaging (EPI), gearbeitet. Zur Analyse ist ein vollständiges Paket für die Vorprozessierung und Registrierung von funktionellen und anatomischen Bildern sowie für die Analyse von Funktionsdaten entwickelt worden, das routinemäßig angewandt wird.

Die Zukunft der SCAs

In jüngerer Zeit gab es Veröffentlichungen zu neuartigen Gd3+-Chelat-Arten mit ähnlicher Komplexstabilität, aber viel höheren Relaxivitätswerten im Vergleich zu DO3A-Systemen [6, 7]. Eine höhere Zahl an koordinierten Wassermolekülen und Resistenz gegenüber reversibler Anionenbindung (die das T1-Signal in DO3A-Chelaten reduziert) könnte sogar zu noch höheren Relaxivitätsveränderungen des SCAs bei Interaktion mit Ca2+ führen. Ziel dieser Forschungsrichtung wäre daher die Synthese der heutigen SCA-Analoga, wobei DO3A-Einheiten (MR-Reporter) durch die oben erwähnten neuartigen Chelate ersetzt werden.

Originalveröffentlichungen

1.
I. Mamedov, A. Mishra, G. Angelovski, H. A. Mayer, L. O. Palsson, D. Parker, N. K. Logothetis:
Synthesis and characterization of lanthanide complexes of DO3A-alkylphosphonates.
Dalton Transactions 45, 5260-5267 (2007).
2.
K. Dhingra, M. E. Maier, M. Beyerlein, G. Angelovski, N. K. Logothetis:
Synthesis and characterization of a smart contrast agent sensitive to calcium.
Chemical Communications 29, 3444 – 3446 (2008).
3.
K. Dhingra, P. Fouskova, G. Angelovski, M. E. Maier, N. K Logothetis, E. J. Toth:
Towards extracellular Ca2+ sensing by MRI: synthesis and calcium-dependent 1H and 17O relaxation studies of two novel bismacrocyclic Gd3+ complexes.
Journal of Biological Inorganic Chemistry 13(1), 34 – 46 (2008).
4.
A. Mishra, P. Fouskova, G. Angelovski, E. Balogh, A. K. Mishra, N. K. Logothetis, E. Toth:
Facile synthesis and relaxation properties of novel bis-polyazamacrocyclic Gd3+ complexes: an attempt towards calcium sensitive MRI contrast agents.
Inorganic Chemistry 47(4), 1370–1381 (2008).
5.
G. Angelovski, P. Fouskova, I. Mamedov, S. Canals, E. Toth, N. K. Logothetis:
Smart magnetic resonance imaging agents that sense extracellular calcium fluctuations.
ChemBioChem 9, 1729–1734 (2008).
6.
S. Aime, L. Calabi, C. Cavallotti, E. Gianolio, G. B. Giovenzana, P. Losi, A. Maiocchi, G. Palmisano, M. Sisti:
A new structural entry for an improved generation of MRI contrast agents.
Inorganic Chemistry 43, 7588–7590 (2004).
7.
E. J. Werner, A. Datta, C. J. Jocher, K. N. Raymond:
High-relaxivity MRI contrast agents: where coordination chemistry meets medical imaging.
Angewandte Chemie International Edition 47, 8568–8580 (2009).
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