Forschungsbericht 2010 - Max-Planck-Institut für molekulare Genetik

Protein-Netzwerke: Wie Protein-Wechselwirkungen das Aussehen und die Funktion der Zelle bestimmen

Autoren
Stelzl, Ulrich
Abteilungen

Otto-Warburg-Laboratorium - Molekulare Interaktions-Netzwerke (Dr. Ulrich Stelzl)
MPI für molekulare Genetik, Berlin

Zusammenfassung
Die systematische Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist ein wichtiger Teil der funktionellen Genomforschung. Eine Methode ist das Hefe-zwei-Hybrid-Verfahren, mit dem Millionen Kombinationen von Proteinpaaren auf mögliche Interaktionen geprüft werden können. Die gefundenen Interaktionen werden in Protein-Netzwerken dargestellt. Diese erlauben ein systembiologisches Verstehen molekularer Zusammenhänge innerhalb der Zelle und sind auch in der Medizin von Bedeutung. Mithilfe solcher Netzwerke können Krankheitsgene identifiziert und Patientendaten besser interpretiert werden.

Einführung

Proteomweite Interaktionsstudien zeigen, dass Funktion und Aussehen einer Zelle – ihr Phänotyp – nicht durch einzelne Proteine bestimmt wird. Vielmehr ist ein sehr komplexes Zusammenspiel von hunderten, manchmal tausenden unterschiedlichen Proteinen für den Phänotyp einer Zelle verantwortlich. Bioinformatische Analysen von Protein-Netzwerken belegen darüber hinaus, dass nicht nur die Aktivität der Proteine an sich, sondern auch die Art und Weise, wie sie miteinander verbunden sind, ausschlaggebend für ihre Funktion sein kann. Die Entschlüsselung von Protein-Netzwerken kann Forscher darin unterstützen, molekulare Zusammenhänge innerhalb der Zelle zu beschreiben. Bestimmte Zelleigenschaften können außerdem im Computer modelliert werden, um sie besser zu verstehen. Mithilfe der Netzwerke können schließlich Krankheitsgene identifiziert und Patientendaten besser interpretiert werden.

Interaktomforschung: Proteine sind Teamplayer

Nach dem Abschluss der Sequenzierung des Humangenoms begannen Forscher, sich auf die systematische Untersuchung von menschlichen Proteinen zu konzentrieren [1]. Proteine sind Teamplayer, sie interagieren mit vielen anderen Proteinen, um ihre Aufgaben zu erfüllen. Somit können aus dem Wissen um die Funktion eines Proteins Rückschlüsse auch auf die Funktion der interagierenden Proteine gezogen werden. Durch die Kartierung von umfangreichen Protein-Netzwerken, in denen jedes Protein sowohl direkt als auch indirekt mit verschiedenen anderen Proteinen - seinen Interaktionspartnern – assoziiert ist, wird die Funktionszuordnung erleichtert. Definierte Gruppen von interagierenden Proteinen können wiederum mit experimentellen und bioinformatischen Verfahren effizient nachgewiesen werden. Ziel der Interaktionsforschung ist es, möglichst alle Wechselwirkungen, die in einer Zelle vorkommen können - Wissenschaftler sprechen vom Interaktom - in einer Karte zu sammeln. Mit diesem Protein-Netzwerk der Zelle sollen Hinweise auf die Funktion möglichst aller menschlichen Proteine gewonnen werden. Im Weiteren sollen gezielt Karten unterschiedlicher Zellen, zum Beispiel einer Nerven- oder einer Leberzelle, erzeugt werden. Das Ziel ist es, besser zu verstehen, wie Zellen bei gleicher genetischer Ausstattung ihre unterschiedlichen Funktionen und ihr häufig auch sehr unterschiedliches Aussehen realisieren. Nicht zuletzt sind solche Karten hilfreich, um zu erkennen, welche molekularen Veränderungen im Krankheitsfall vor sich gehen, wenn beispielsweise eine Zelle sich zu teilen beginnt und zur Krebszelle wird.

Das Hefe-zwei-Hybrid-Verfahren

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Original 1293749692
Prinzip des Hefe-zwei-Hybrid-Verfahrens zur Identifizierung von Protein-Protein Wechselwirkungen. Hybridproteine (DB-X und AD-Y) werden durch das Zusammenfügen menschlicher Proteine (X und Y) mit zwei Domänen eines Transkriptionsfaktors (AD und DB) in Hefestämmen hergestellt. Durch Verschmelzen zweier Stämme können unterschiedliche Proteinkombinationen (X und Y sind variabel) hergestellt werden (Schritt 1). Die Stämme wachsen zunächst auf einem Nährboden, der alle essenziellen Nährstoffe enthält; jeder Hefestamm entspricht dabei einer individuellen Kombination zweier Proteine. Im zweiten Schritt werden die Hefestämme auf Nährböden übertragen, denen bestimmte Nährstoffe fehlen. Nur wenn die Proteine X und Y miteinander interagieren, kann der Transkriptionsfaktor aus AD und DB funktionell wiederhergestellt werden und die Hefe die fehlenden Nährstoffe selbständig produzieren. Der Nährboden rechts im Bild zeigt drei solcher paarweisen Interaktionen. Mithilfe von Robotern können sehr viele Kombinationen von möglichen Interaktionen getestet werden. Diese Experimente bilden die Grundlage für die Herstellung und Analyse von Protein-Netzwerken.
Prinzip des Hefe-zwei-Hybrid-Verfahrens zur Identifizierung von Protein-Protein Wechselwirkungen. Hybridproteine (DB-X und AD-Y) werden durch das Zusammenfügen menschlicher Proteine (X und Y) mit zwei Domänen eines Transkriptionsfaktors (AD und DB) in Hefestämmen hergestellt. Durch Verschmelzen zweier Stämme können unterschiedliche Proteinkombinationen (X und Y sind variabel) hergestellt werden (Schritt 1). Die Stämme wachsen zunächst auf einem Nährboden, der alle essenziellen Nährstoffe enthält; jeder Hefestamm entspricht dabei einer individuellen Kombination zweier Proteine. Im zweiten Schritt werden die Hefestämme auf Nährböden übertragen, denen bestimmte Nährstoffe fehlen. Nur wenn die Proteine X und Y miteinander interagieren, kann der Transkriptionsfaktor aus AD und DB funktionell wiederhergestellt werden und die Hefe die fehlenden Nährstoffe selbständig produzieren. Der Nährboden rechts im Bild zeigt drei solcher paarweisen Interaktionen. Mithilfe von Robotern können sehr viele Kombinationen von möglichen Interaktionen getestet werden. Diese Experimente bilden die Grundlage für die Herstellung und Analyse von Protein-Netzwerken.

Eine der wichtigsten Methoden zur proteomweiten Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen ist das Hefe-zwei-Hybrid-Verfahren. Dabei handelt es sich um ein inzwischen weitgehend automatisiertes Verfahren, das die Bäckerhefe quasi als Versuchslabor einsetzt. Die Methode basiert auf der Erkenntnis, dass Transkriptionsfaktoren, die zentralen Steuerungselemente bei der Regulation von Genen [2], in eine Aktivierungs- (AD) und eine DNA-Bindungsdomäne (DB) zerlegt werden können, ohne dass diese ihre Funktionalität verlieren. Werden die beiden Domänen beispielsweise mit den menschlichen Proteinen X und Y fusioniert, welche miteinander interagieren (DB-X und AD-Y), so wird der Transkriptionsfaktor in der Hefezelle wieder zusammengesetzt und ist damit in der Lage, zum Beispiel die Produktion eines essenziellen Nährstoffes anzukurbeln. Dies ermöglicht es, mittels Wachstumstests auf speziellen Nährmedien Protein-Protein-Interaktionen indirekt nachzuweisen (Abb. 1). Da mithilfe von Robotern Wachstumstests von sehr vielen Hefekulturen gleichzeitig durchgeführt werden können, werden Millionen von Protein-Kombinationen auf mögliche paarweise Interaktionen in absehbarer Zeit überprüfbar. Aus den gewonnenen Daten werden die Protein-Netzwerke erstellt.

Das menschliche Interaktom

Mit dem Hefe-zwei-Hybrid-Verfahren wurden zuerst Protein-Netzwerke für den Fadenwurm und die Fruchtfliege erstellt. Später ist es auch gelungen, die ersten großen Protein-Netzwerke für menschliche Zellen zu erstellen [3, 4]. Protein-Netzwerke, wie sie zurzeit von Forschern generiert werden, enthalten aber nur einen Bruchteil der Wechselwirkungen, die in Zellen wirklich vorkommen können. Die Max-Planck-Forschungsgruppe „Molekulare Interaktionsnetzwerke“ hat in Zusammenarbeit mit internationalen Forschergruppen ein Konzept erarbeitet, welches Routen zur Erstellung vollständiger Netzwerke aufzeigt. In speziell entworfenen Experimenten konnte gezeigt werden, dass das Konzept umsetzbar ist und einen Weg zur Entschlüsselung des menschlichen Interaktoms darstellt [5]. Es ist jedoch klar, dass solch eine immense Aufgabe nur durch koordinierte internationale Zusammenarbeit bewältigt werden kann.

Netzwerke für ein besseres Verständnis von Krankheitsprozessen

In der Zwischenzeit sind auch unvollständige Protein-Netzwerke eine wertvolle Basis für viele weiterführende Studien geworden. Spezielle Netzwerke, die auf bekannte Krankheitsgene fokussieren, wie zum Beispiel DISC1/Schizophrenie, Htt/Chorea Huntington oder SCA/erbliche Ataxien, offenbaren Ansatzpunkte für die gezielte Identifizierung sogenannter Krankheitsmodulatoren, also derjenigen Proteinfaktoren, die den Krankheitsverlauf beeinflussen. Mithilfe dieser Netzwerke konnten neue Proteine mit den entsprechenden Krankheitsprozessen in Verbindung gebracht werden (zusammengefasst in [6]).

In Zukunft wird es notwendig sein, die Ergebnisse der funktionellen Genomforschung, wie Protein-Netzwerkkarten, Genexpressionsdaten, Daten zu Phosphorylierungsmustern oder Daten zu Metaboliten, zu einem molekularen Gesamtbild der Zelle zusammenzufügen [7]. Für dieses systembiologische Unterfangen müssen alle Komponenten einer Zelle parallel und quantitativ unter verschiedenen Gesichtspunkten und zu verschiedenen Zeitpunkten analysiert werden. Die gewonnenen Informationen müssen durch komplexe bioinformatische Methoden zusammen geführt werden [8]. Wenn es gelingt, zelluläre Prozesse auf der molekularen Ebene komplett zu erfassen, wird es möglich sein, diese Prozesse als molekulares System zu verstehen und die Mechanismen von Funktionsstörungen zu erkennen, die für die Entwicklung von Krankheiten ausschlaggebend sein können.

Originalveröffentlichungen

1.
H. Lehrach:
Von der genetischen Information zur Behandlung von Krankheiten.
Jahrbuch der Max-Planck-Gesellschaft, 2005.
2.
M. Vingron:
Untersuchung von Bindungsstellen zur Aktivität von Genen.
Jahrbuch der Max-Planck-Gesellschaft, 2005.
3.
U. Stelzl, U. Worm, M. Lalowski, C. Haenig, F. H. Brembeck, H. Goehler, M. Stroedicke, M. Zenkner, A. Schoenherr, S. Koeppen, J. Timm, S. Mintzlaff, C. Abraham, Bock N., S. Kietzmann, A. Goedde, E. Toksz, A. Droege, S. Krobitsch, B. Korn, W. Birchmeier, H. Lehrach, E. E. Wanker:
A human protein-protein interaction network: a resource for annotating the proteome.
Cell 122, 957-968 (2005).
4.
J. F. Rual, K. Venkatesan, T. Hao, T. Hirozane-Kishikawa, A. Dricot, N. Li, G. F. Berriz, F. D. Gibbons, M. Dreze, N. Ayivi-Guedehoussou, N. Klitgord, C. Simon, M. Boxem, S. Milstein, J. Rosenberg, D. S. Goldberg, L. V. Zhang, S. L. Wong, G. Franklin, S. Li, J. S. Albala, J. Lim, C. Fraughton, E. Llamosas, S. Cevik, C. Bex, P. Lamesch, R. S. Sikorski, J. Vandenhaute, H. Y. Zoghbi, A. Smolyar, S. Bosak, R. Sequerra, L. Doucette-Stamm, M. E. Cusick, D. E. Hill, F. P. Roth, M. Vidal:
Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.
Nature 437, 1173-1178 (2005).
5.
K. Venkatesan, J. F. Rual, A. Vazquez, U. Stelzl, I. Lemmens, T. Hirozane-Kishikawa, T. Hao, M. Zenkner, X. Xin, K. I. Goh, M. A. Yildirim, N. Simonis, K. Heinzmann, F. Gebreab, J. M. Sahalie, S. Cevik, C. Simon, A. S. de Smet, E. Dann, A. Smolyar, A. Vinayagam, H. Yu, D. Szeto, H. Borick, A. Dricot, N. Klitgord, R. R. Murray, C. Lin, M. Lalowski, J. Timm, K. Rau, C. Boone, P. Braun, M. E. Cusick, F. P. Roth, D. E. Hill, J. Tavernier, E. E. Wanker, A. L. Barabsi, M. Vidal:
An empirical framework for binary interactome mapping.
Nature Methods 6, 83-90 (2009).
6.
T. Ideker, R. Sharan:
Protein networks in disease.
Genome Research 18, 644-652 (2008).
7.
U. Stelzl, E. E. Wanker:
The value of high quality protein-protein interaction networks for systems biology.
Current Opinion in Chemical Biology 10, 551-558 (2006).
8.
C. Wierling, R. Herwig:
Computergestützte Modellierung biologischer Prozesse.
Jahresbericht der Max-Planck-Gesellschaft, 2008.
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