Forschungsbericht 2005 - Max-Planck-Institut für chemische Energiekonversion

Erzeugung und Umsetzung von molekularem Wasserstoff durch Hydrogenasen

Production and Consumption of Molecular Hydrogen by Hydrogenases

Autoren
van Gastel, Maurice; Reijerse, Eduard J.; Lubitz, Wolfgang
Abteilungen

Biophysikalische Chemie (Prof. Dr. Wolfgang Lubitz)
MPI für bioanorganische Chemie, Mülheim an der Ruhr

Zusammenfassung
Molekularer Wasserstoff (H2) ist ein wichtiger umweltfreundlicher Energieträger für Anwendungen, z.B. in Brennstoffzellen, an denen derzeit weltweit geforscht wird. Bisher stellt die großtechnische Produktion von Wasserstoff aus Wasser mittels Sonnenlicht allerdings noch eine große Herausforderung dar. In der Natur nutzen Bakterien dieses Molekül als Energiequelle, die in sauerstoffarmer Umgebung leben. Die Hauptklassen der Hydrogenasen – der Enzyme, die Erzeugung oder Umsetzung von H2 katalysieren – wurden spektroskopisch mit EPR- und FTIR-Methoden und mit quantenchemischen Berechnungen untersucht, um den Reaktionsmechanismus aufzuklären.
Summary
Molecular hydrogen (H2) is an important energy carrier in environmentally-friendly applications, e.g. clean fuel cells, which are under development worldwide. However, presently the large scale production of hydrogen from water and sunlight is still a major challenge. In nature anaerobic bacteria use this molecule as energy source. The two major classes of hydrogenases, the enzymes that catalyze the production or the splitting of H2, were investigated by means of EPR and FTIR spectroscopy and quantumchemical calculations to elucidate the reaction mechanism.

Molekularer Wasserstoff, (H2), ist ein wichtiger Energieträger für zukünftige Anwendungen in umweltfreundlichen Motoren oder Brennstoffzellen. Als Basis der zukünftigen H2-Versorgung wird weltweit an der Produktion des Wasserstoffs aus Wasser mittels Sonnenlicht geforscht. In der Natur wird dieses Molekül als Energiequelle durch Bakterien genutzt, die in sauerstoffarmer Umgebung leben und daher einen Metabolismus basierend auf Wasserstoff anstelle des Sauerstoffs haben. Vermutlich existierte der Wasserstoff-Metabolismus bereits lange bevor die Atmosphäre der Erde Sauerstoff enthielt und ging damit dem Sauerstoff-Metabolismus voraus.

Die Enzyme, die Wasserstoff in diesen Bakterien produzieren oder spalten, werden Hydrogenasen genannt. Die genaue Kenntnis der Struktur und Funktion dieser Enzyme ist von fundamentaler Bedeutung für eine zukünftige biologisch-basierte Wasserstofftechnologie, aber auch für den Bau bioanorganischer Modelle für das katalytische Zentrum, die ebenfalls für einen technischen Einsatz in Frage kommen.

Alle heute bekannten Hydrogenasen sind Metalloenzyme. Abhängig von der Art der Metallionen im Reaktionszentrum, an dem Wasserstoff bindet, kann eine Klassifikation von Hydrogenasen vorgenommen werden. Die zwei größten Klassen sind die Nickel-Eisen-(NiFe)-Hydrogenasen und die Eisen-Eisen-(FeFe)-Hydrogenasen, welche beide ein dinukleares Metallzentrum besitzen.

Die Struktur, Funktion und spezifische Aktivität dieser Enzyme ist mit zahlreichen Methoden studiert worden, sie reicht von biochemischen und molekularbiologischen Studien bis zur strukturanalytischen, spektroskopischen und quantenmechanischen Charakterisierung. Auch die Synthese und Charakterisierung von bioanorganischen Modellkomplexen spielt eine wichtige Rolle, da diese wesentliche Aspekte der katalytischen Funktion nachbilden können, wie einige Arbeitsgruppen bereits gezeigt haben. Von großer Bedeutung auf diesem Forschungsfeld ist die Ermittlung der Struktur der verschiedenen Zwischenzustände (Intermediate) des Reaktionszyklus, die unterschiedlichen Ladungs-(Redox)-Zuständen des katalytischen Metallzentrums entsprechen. Spektroskopische Untersuchungen tragen hier entscheidend zum Verständnis dieser Zustände und damit des Reaktionsmechanismus auf elektronischem Niveau bei.

NiFe-Hydrogenasen

Nickel-Eisen-Hydrogenasen bestehen hauptsächlich aus zwei Untereinheiten (Abb. 1). Die große Untereinheit beherbergt das Reaktionszentrum, an dem molekularer Wasserstoff bindet. In der kleinen Untereinheit befinden sich drei Eisen-Schwefel-Cluster, die Teil einer Elektrontransportkette sind. Das Protein enthält ferner einen Gaskanal („Wasserstoffkanal“) und eine Protonentransferkette („Protonenkanal") zum An- und Abtransport der Edukte und Produkte. Dies ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt.

Schematische Darstellung einer Nickel-Eisen-Hydrogenase mit großer (grün) und kleiner (blau) Untereinheit (Molekulargewicht insgesamt ca. 90 kDa). Das binukleare NiFe-Zentrum, die drei Eisen-Schwefel-Zentren (FeS) sowie der Wasserstoff- und Protonenkanal sind angedeutet.

Die Struktur der NiFe-Hydrogenase wurde bereits in den neunziger Jahren durch Röntgenstrukturanalyse an Hydrogenase-Einkristallen in Grenoble (Frankreich) und kurz darauf auch in Kyoto (Japan) ermittelt. Das aktive Zentrum enthält Nickel und Eisen koordiniert von vier Aminosäuren (Cysteinen) der großen Untereinheit und drei zweiatomigen anorganischen Liganden. Mittels Infrarotspektroskopie wurden diese Liganden als zwei Cyanide (CN-) und ein Kohlenmonoxid (CO) identifiziert, was für ein Protein sehr ungewöhnlich ist. Im oxidierten Zustand wurde ein zusätzlicher verbrückender Ligand (X) gefunden, der im reduzierten Zustand des Enzyms nicht beobachtet wurde. Das Metallzentrum hat damit freie Bindungsstellen, was eine Anlagerung von Wassserstoff ermöglicht. Die Struktur des aktiven Zentrums der [NiFe]-Hydrogenase ist in Abbildung 2b dargestellt.

Die exakte Geometrie des Nickel-Eisen-Zentrums hängt vom Redox-Zustand des Enzyms ab, den es während des katalytischen Zyklus annimmt. Die Charakterisierung dieser Zustände ist allein mit Röntgenkristallographie nicht möglich, da diese Zustände sich in den Einkristallen nur schwer oder gar nicht erzeugen lassen. Ferner ist diese Methode für Wasserstoffkerne – d.h. für Substrat und Produkt dieses Enzyms – blind. Hier ist der Einsatz spektroskopischer Methoden erforderlich, insbesondere solcher, die hohe Empfindlichkeit für Wasserstoffkerne aufweisen, wie die Techniken der magnetischen Resonanzspektroskopie (EPR und NMR).

Die Redox-Zustände Ni-A, Ni-B, Ni-C und Ni-L des Reaktionszentrums sind paramagnetisch (sie weisen ein ungepaartes Elektron auf) und sind damit der EPR (Electron Paramagnetic Resonance) Spektroskopie zugänglich. Mit dieser Technik wurden in unserem Labor von allen paramagnetischen Intermediaten an Hydrogenase-Einkristallen des Bakteriums Desulfovibrio (D.) vulgaris Miyazaki F die Spektren orientierungsabhängig gemessen und Größe und Orientierung der spektroskopischen Parameter entnommen (z. B. Zeeman-Aufspaltung: g-Tensor). Ein Beispiel ist in Abbildung 2a, der sich ergebene g-Tensor und seine Lage im aktiven Zentrum in Abbildung 2b gezeigt. Die g-Tensorwerte werden als „spektroskopischer Fingerabdruck“ zur Identifizierung des jeweiligen Zustands genutzt. Sie können auch mittels moderner quantenchemischer Verfahren (Dichtefunktionaltheorie, DFT) an geometrie-optimierten Strukturen berechnet werden. Der Vergleich der experimentellen und theoretischen Daten lieferte Aufschlüsse über die Redox- und Spinzustände der Metalle im Reaktionszentrum und wichtige geometrische Details des katalytischen Zentrums (z. B. Art der Brückenliganden).

Das ungepaarte Elektron ist über das Reaktionszentrum delokalisiert und wechselwirkt mit denjenigen Kernen, die ebenfalls ein magnetisches Moment haben (sog. Hyperfeinwechselwirkung, HFC). Die HFC ist häufig in den EPR-Spektren nicht aufgelöst. Mehrfachresonanztechniken wie ENDOR (Electron Nuclear DOuble Resonance) und mehrdimensionale Puls-EPR-Verfahren (HYSCORE) sind in der Lage, diese sehr kleinen Wechselwirkungen zu messen. Die Abbildung 2c zeigt ENDOR-Spektren von einem Hydrogenase-Einkristall zur Ermittlung der HFC mit Protonen (1H) des aktiven Zentrums, die Abbildung 2d ein sog. HYSCORE-Spektrum zur Messung der HFC des Stickstoffs (14N). Die HFCs wurden ebenfalls mit DFT berechnet und mit den experimentellen Daten verglichen.

Übersicht über das NiFe-Reaktionszentrum in Hydrogenasen und die zum Studium der funktionellen Zusammenhänge eingesetzten EPR-Techniken. Alle Experimente am Ni-B-Zustand in Einkristallen der Hydrogenase aus D. vulgaris Miyazaki F.

Daten dieser Art sind von allen paramagnetischen Zuständen der Hydrogenasen erhalten worden und führten zu einem detaillierten Bild der elektronischen und geometrischen Struktur des katalytischen Zentrums. Die wesentlichen Ergebnisse sind:
(1) Das Eisen befindet sich stets im diamagnetischen Fe(II)-Zustand („low spin“), es ist nicht redoxaktiv und bindet höchstwahrscheinlich nicht den Wasserstoff.

(2) Das Nickel dagegen wechselt die Oxidationsstufe (redoxaktiv) im Katalysezyklus (Wechsel zwischen Ni(III) paramagnetisch und Ni(II) diamagnetisch).

(3) Der oxidierte aktive Zustand des Enzyms (Ni-B) trägt in der Brückenposition ein Hydroxylion (OH-), welches nach Protonierung als Wasser abgegeben werden kann.
(4) Das Ni bindet und aktiviert den Wasserstoff an seiner freien Koordinationsstelle (heterolytische H2-Spaltung).
(5) Das zentrale Intermediat Ni-C im Katalysezyklus trägt ein Hydrid in der Brückenposition zwischen Ni und Fe.

(6) Belichtung von Ni-C erzeugt den Zustand Ni-L, welcher das Hydrid als Proton verloren hat (Protonierung eines Cysteins?) und formal ein Ni(I) enthält. Dieser Prozess ist reversibel.

(7) Die Hydrogenase wird durch Sauerstoff (Ni-A-Zustand) und durch Kohlenmonoxid (Ni-CO) inhibiert. In beiden Fällen wird die freie Bindungsstelle am Nickel blockiert, so dass H2 wahrscheinlich nicht mehr binden kann.

Die sog. „EPR-silent states“ können mit der EPR nicht erfasst werden, hier musste zusätzlich FTIR-Spektroskopie eingesetzt werden. Die „Sonden“ der FTIR-Spektroskopie sind die CO- und CN-Schwingungen der Liganden des Eisens. Sie weisen definierte IR-Absorptionen auf, die sich je nach Zustand, in dem sich die Hydrogenase befindet, verschieben und durch die IR-Spektroskopie empfindlich nachgewiesen werden können. Die FTIR-Spektroskopie kann an allen Zuständen durchgeführt werden und ist empfindlich auf Ladungsdichteänderungen am Eisen.

Die Analyse der Absorptionsbanden und ihrer Verschiebungen erlaubt damit Rückschlüsse auf die Struktur und Funktion des aktiven Zentrums und trägt dazu bei, den Reaktionsmechanismus besser zu verstehen. Eine Kombination von FTIR-Spektroskopie und Elektrochemie erlaubt die selektive Einstellung bestimmter Redox-Zustände durch Anlegen eines definierten Potenzials an die Hydrogenase unter gleichzeitiger Aufnahme des Infrarot-Spektrums. Mithilfe dieser Technik konnten die Redoxpotenziale der einzelnen Übergänge für die Hydrogenase aus D. vulgaris Miyazaki F sowie ihre pH-Wert-Abhängigkeit bestimmt werden. Diese spektroelektrochemischen Messungen führten zu folgenden wesentlichen Ergebnissen:

(1) Das Eisen trägt 1 CO- und 2 CN--Liganden.

(2) Die Redox-Potenziale konnten für alle Übergänge bestimmt werden, sie liegen etwa im Bereich -100 bis -440 mV.
(3) Jeder Elektronentransfer ist im Katalysezyklus von einem Protonentranfer-Schritt begleitet.
(4) Der EPR-inaktive Ni-SI-Zustand, welcher H2 bindet, existiert in einem Protonierungsgleichgewicht (Protonierung eines Cysteins).

Die EPR-, FTIR- und theoretischen Ergebnisse führten zur Aufstellung eines Mechanismus für die heterolytische Wasserstoffspaltung, der in Abbildung 3 in groben Zügen gezeigt ist.

Vorgeschlagene Strukturen der verschiedenen Redox-Zustände der Nickel-Eisen-Hydrogenase auf der Basis von quantenchemischen Berechnungen und EPR/FTIR-Experimenten (siehe Text).

FeFe-Hydrogenasen

Von Eisen-Eisen-Hydrogenasen wird angenommen, dass sie zu den ältesten Enzymen in der Natur gehören. Sie werden z. B. im Periplasma von Schwefel-reduzierenden Bakterien gefunden. Die Wasserstoffproduktion der FeFe-Hydrogenase ist bemerkenswert hoch. Allerdings ist dies mit einem Nachteil verbunden: auch die Sauerstoff-Empfindlichkeit des Enzyms ist sehr hoch. Dies begrenzt bislang die Einsatzmöglichkeiten dieses Hydrogenase-Typs in Studien zur Wasserstoffproduktion, z.B. durch Verwendung photosynthetisierender Bakterien.

Das Protein enthält neben dem Reaktionszentrum (dem so genannten H-Cluster), auch zwei Fe4S4-Cubane, die als Elektronentransport-Relais dienen. Der H-Cluster selbst (siehe Abb. 4) besteht aus zwei Eisen-Unterclustern: einer Cuban-Struktur (Abb. 4, links), die im Protein in der üblichen Weise durch vier Cystein-Liganden verankert ist, und einer zweikernigen Struktur, die mit dem Cuban nur durch eine einzelne Cystein-Brücke verbunden ist. Diese Einheit (Abb. 4, rechts) enthält CN-- und CO-Liganden sowie ein die beiden Metallzentren überbrückendes Dithiolat. Überraschenderweise gibt es keine weiteren Verbindungen zwischen der zweikernigen Struktur und dem Protein. Man könnte sich vorstellen, dass die zweikernige Einheit als unabhängiger anorganischer Katalysator in der Ursuppe arbeitete und später in eine Proteinmatrix eingefangen wurde. In der Tat stellte sich heraus, dass anorganische Modellkomplexe, die der zweikernigen Einheit ähneln, relativ einfach synthetisiert werden können und recht stabil sind.

Struktur des H-Clusters der FeFe-Hydrogenase (nach Fontecilla-Camps, Grenoble, Frankreich). Der Pfeil deutet die freie Koordinationsstelle des distalen Fed an, wo auch das CO angelagert wird.

Im aktivierten Zustand enthält der H-Cluster eine freie Koordinationsstelle am „distalen Eisen“ (Fed, Abb. 4), fern von der Fe4S4-Cuban-Struktur. Es wird angenommen, dass hier der molekulare Wasserstoff bindet, bevor er oxidiert wird (oder freigesetzt wird, wenn das Enzym in der anderen Richtung arbeitet).

Verglichen mit NiFe-Hydrogenasen ist der Mechanismus der Wasserstoffaufnahme bzw. -abgabe in den FeFe-Hydrogenasen weniger gut verstanden. Selbst über die korrekten Oxidations-Zustände der einzelnen Eisenatome im zweikernigen Cluster in den verschiedenen Zuständen des Proteins wird noch debattiert. Der zweikernige Cluster kann im reduzierten Zustand entweder [FeI,FeI] oder [FeII,FeII] sein, und im oxidierten Zustand [FeI,FeII] oder [FeII, FeIII]. Mössbauer-Studien von Jose J. M. Moura (Lissabon) und Mitarbeitern haben gezeigt, dass während der reduktiven Aktivierung des Enzyms die Ladung vorübergehend auf dem Cuban-Untercluster gespeichert wird. Dieser Zustand ist paramagnetisch und ergibt ein rhombisches Muster im EPR-Spektrum. Durch eine Konformationsänderung (und unter Verlust des terminalen OH--Liganden) wird der aktive oxidierte Zustand [Hox] des Enzyms (paramagnetisch) erreicht.

In Abbildung 5 ist das derzeit generell akzeptierte Schema der unterschiedlichen Zustände des H-Clusters zusammengefasst. Die in Rot dargestellten Zustände sind paramagnetisch und können daher mit EPR untersucht werden. Von diesen ist nur der oxidierte Zustand [Hox] direkt am katalytischen Prozess beteiligt.

Vorschlag für die Redox-Zustände des H-Clusters im katalytischen Zyklus einschließlich der Redox-Zustände des Cuban-Clusters. repräsentiert die freie Koordinationsstelle.

Das Enzym wird reversibel durch CO gehemmt, welches an der offenen Position koordiniert. Auch dieser Zustand ist paramagnetisch. Durch Untersuchung von 57Fe-angereicherten Enzymen mit Puls- und Doppelresonanz-EPR-Techniken bei 35 GHz konnte die Verteilung des ungepaarten Elektronenspins über die sechs Eisenatome des H-Clusters sowohl im Hox- wie im HoxCO-Zustand kartographiert werden (siehe Abb. 6). Obwohl formal nur das proximale Eisen Fep paramagnetisch ist (FeI), stellte sich heraus, dass alle sechs Eisenatome Spindichte aufweisen, die durch elektronische Austausch­wechselwirkung zwischen den Eisenatomen verursacht wird. Das hier erhaltene Resultat der Spindichteverteilung bestätigt und verfeinert ein bekanntes Modell für das Elektronaustausch­muster im H-Cluster.

Zweidimensionale gepulste Hochfeld-EPR- und ENDOR-Experimente (bei 35 GHz, 1,2 Tesla) zur Untersuchung des HoxCO-Zustandes des mit 57Fe angereicherten Enzyms. Die Kopplungsmuster, gekennzeichnet mit A1 bis A6, identifizieren alle 6 Eisenkerne im H‑Cluster. Diese Spektren demonstrieren, wie gut die Puls-EPR-Techniken HYSCORE und ENDOR selbst an Metallkernen eingesetzt werden können.

Unabhängige FTIR-Studien zeigten, dass sich der Redox-Zustand des proximalen Eisens beim Übergang von der oxidierten zur reduzierten Form nicht ändert. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass der Paramagnetismus des H-Clusters sogar auf das (formal diamagnetische) Cuban übertragen wird, was nur erklärt werden kann, wenn man annimmt, dass das proximale Eisen formal paramagnetisch ist.

Die Kombination dieser Daten ermöglicht es, das „Redox-Dilemma“ ([I,II] oder [II,III] im oxidierten Zustand) zu entscheiden: die spektroskopischen Daten können nur dadurch erklärt werden, dass das proximale Eisen im oxidierten und im reduzierten Zustand im Zustand Fe(I) verharrt, während das distale Eisen zwischen Fe(I) und Fe(II) wechselt.

Als nächster Schritt soll die Photodissoziation der externen, das Enzym inhibierenden CO-Gruppe wie auch der verbrückenden CO-Gruppe (siehe Abb. 4) untersucht werden, da angenommen wird, dass Ligandenaustausch eine wichtige Rolle im katalytischen Mechanismus spielt.

Die oben genannten spektroskopischen Untersuchungen haben einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des Wirkmechanismus der [NiFe]-und [FeFe]-Hydrogenasen geliefert. Obwohl noch nicht alle Details des Mechanismus erfasst werden konnten, können die fehlenden Schritte anhand der hier dargestellten Ergebnisse bereits recht zuverlässig vorausgesagt werden. Diese Schritte werden voraussichtlich in der nächsten Zeit spektroskopisch in unserer Gruppe verifiziert werden. In Kooperation mit Frank Neese werden ferner weitere DFT-Rechnungen zur elektronischen Struktur und zum Mechanismus durchgeführt, um Unterschiede und Gemeinsamkeiten der beiden Enzymklassen besser zu verstehen.

Zur Redakteursansicht