Forschungsbericht 2005 - Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie

Zellwanderungen im Embryo des Zebrafisches: Wie Zellen ihren Weg beim Aufbau von Organen finden

Autoren
Gilmour, Darren; Knaut, Holger; Nüsslein-Volhard, Christiane
Abteilungen

Abt. 3: Genetik (Nüsslein-Volhard) (Prof. Dr. Christiane Nüsslein-Volhard)
MPI für Entwicklungsbiologie, Tübingen

Zusammenfassung
Die Wanderung einer Zelle im Organismus ist ein komplizierter Prozess, der von einer genau gesteuerten Aktivität des Zytoskeletts in unterschiedlichen Regionen der Zelle bewirkt wird. Zellwanderungen sind bei der Wirbeltier-Entwicklung von fundamentaler Bedeutung, da die dreidimensionale Struktur vieler Organe durch gemeinsame Migration vieler Zelltypen gebildet wird. Solche Wanderungsprozesse spielen beim Aufbau des Nervensystems und der Blutgefäße eine große Rolle. Die gemeinsamen Wanderungen von vielen Zellen unterschiedlicher Herkunft müssen sehr genau koordiniert sein, damit jede einzelne Zelle an den richtigen Ort gelangt – es ist aber noch sehr wenig darüber bekannt, wie ein Embryo diese logistische Meisterleistung vollbringt. Embryonen des Zebrafisches Danio rerio haben viele Eigenschaften, die sie zu einem idealen Modellorganismus machen, um dieses dynamische Zellverhalten in vivo zu untersuchen: Die Embryonal-Entwicklung verläuft außerhalb des Mutterleibs und sie läuft sehr schnell ab, denn schon innerhalb von 24 Stunden nach der Befruchtung sind die meisten Organsysteme angelegt. Fischembryonen sind außerdem vollkommen durchsichtig - dies erlaubt, sie mithilfe von hochauflösenden Zeitraffer-Filmen im lebenden Zustand zu beobachten und zu untersuchen.

Die Wanderung der Keimzellen

Jede Zelle enthält die gesamte Erbinformation eines Tieres, aber nur die Keimbahnzellen können diese Information an die nächste Generation weitergeben: Sie sind die Vorläufer der Samen- und Eizellen. Schon während der frühen Entwicklung des Embryos grenzen sich wenige Zellen als Keimbahnzellen von den übrigen (somatischen) Zellen des Körpers ab. Sie beginnen sich zu teilen und wandern dann durch den Embryo zu der Stelle, an der sich später die Geschlechtsorgane (Gonaden) bilden. Obwohl man durch Untersuchungen in Fliegen, Würmern und Mäusen bereits viele Faktoren aufgespürt hat, die bei der Bildung von Keimbahnzellen eine Rolle spielen, war bisher nicht klar, wie Keimbahnzellen ihren Weg durch den Embryo finden.

In unserem Labor wurde gemeinsam mit der Biotechnologie-Firma Exelixis Deutschland ein groß angelegtes Mutagenese-Experiment durchgeführt. In diesem Projekt wurde nach Gendefekten gesucht, in denen die verschiedensten Prozesse der Entwicklung betroffen sind. Eine Mutante wurde isoliert, bei der die Wanderung der Keimbahnzellen zu den Gonaden nicht normal verläuft, sondern diese sich wie zufällig im Embryo verteilen. Da viele Keimbahnzellen in diesen Mutanten auf ihrem Weg zu den Gonaden verloren gehen, wurde diese Mutante „Odysseus“ getauft (Abb. 1)[2, 3].

Die Odysseus-Mutante: Zebrafisch-Embryonen, 36 Stunden alt, mit einem Antikörper gegen das keimbahnspezifische Vasa-Protein angefärbt. Oberes Bild: Die Keimzellen haben sich in der Mitte des Embryos neben den Somiten gesammelt. Unteres Bild: In "ody" Embryonen sind sie einzeln über den Embryo verteilt.

Durch einen genetischen Trick lassen sich Keimbahnzellen spezifisch mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) markieren und so in lebenden Embryonen beobachten. Kurz nach ihrer Entstehung (während der Gastrulation) lassen sich die Keimbahnzellen passiv zusammen mit anderen Zellen zur Mittellinie treiben. Von dort aus wandern sie als lose Gruppe aktiv entlang der Körperachse zu der Stelle, an der sich später die Gonaden bilden werden. In Odysseus-Embryonen hingegen können sich Keimbahnzellen zwar noch bewegen, wandern aber einzeln und ziellos durch den Embryo (Abb. 1). Hierfür gibt es zwei mögliche Erklärungen: Entweder verhindert die Odysseus-Mutation, dass Keimbahnzellen die Wegweiser zu den Gonaden erkennen können, oder die Mutation macht die Wegweiser unleserlich. In beiden Fällen würden die Keimbahnzellen ihre Orientierung verlieren.

Durch Transplantation von Zellen lassen sich Embryonen herstellen, bei denen mutante Keimzellen im normalen Embryo wandern und umgekehrt. Dies gibt dem Forscher die Möglichkeit, zwischen den beiden genannten Möglichkeiten zu unterschieden. Es zeigte sich, dass Odysseus-Keimbahnzellen blind für die Wegweiser zu den Gonaden sind. Und es stellte sich heraus, dass die Mutation in Odysseus ein Rezeptorprotein auf der Oberfläche der Keimbahnzellen betrifft, das die wegweisenden Moleküle wahrnimmt. Es handelt sich hierbei um einen bekannten Chemokin-Rezeptor mit dem Namen Cxcr4b.

Interessanterweise gehört Cxcr4b zu einer Gruppe von Rezeptoren, die auch bei ganz anderen Zellwanderungen eine Rolle spielt. So nutzen Leukozyten ähnliche Rezeptoren, um Bakterien im Körper aufzuspüren, zu jagen und dann unschädlich zu machen. Schleimpilze wiederum sind auf diese Rezeptoren in Hungerzeiten angewiesen, um einander zu finden und Sporen zu bilden. Und in Menschen und Mäusen spielt Cxcr4 eine wichtige Rolle bei der Infektion von T-Zellen durch HIV, aber auch bei der Zellwanderung von B-Zellen und Neuronen.

Ein wichtiger Hinweis zur Identifizierung desjenigen Moleküls, welches der Cxcr4b-Rezeptor als Wegweiser benutzt, kam aus der immunologischen Forschung. Dort hatten Studien in Zellkultur und Mäusen gezeigt, dass SDF-1 (stromal cell derived factor 1) der Kopplungspartner (Ligand) von Cxcr4 ist. Dies legte nahe, dass SDF-1 auch während der Wanderung der Keimbahnzellen der Ligand für Cxcr4b sein könnte. Diese Vermutung wurde bestätigt: Erstens wird SDF-1 im Embryo entlang der Wegstrecke von wandernden Keimbahnzellen angeschaltet und zeichnet so den Wanderweg der Keimbahnzellen vor. Zweitens führte eine verminderte Menge von SDF-1 zu orientierungslosen Keimbahnzellen - ähnlich den odysseus-Keimbahnzellen, denen der SDF-1- Rezeptor Cxcr4b fehlt. Und drittens können künstliche Quellen von SDF-1 im Embryo die Keimbahnzellen an falsche Stellen locken und so von ihrem natürlichen Wanderweg abbringen. Bildlich gesprochen „sehen“ die Keimbahnzellen somit die Wegweiser-Moleküle SDF-1 mit dem Rezeptor CXCR4b und finden so ihren Weg durch den Embryo [3].

Das Seitenlinienorgan als Modell für koordinierte Zellbewegungen während der Organbildung

Das mechano-sensorische Seitenlinienorgan besteht aus einer Reihe von Haarzell-Organen, den so genannten Neuromasten, die in die Haut von Fischen und Amphibien eingebettet sind und den Tieren erlauben, Vibrationen im umgebenden Wasser zu spüren. Die Neuromasten entstehen aus einer Gruppe von ca. 100 Epithelzellen (Seitenlinien-Vorläuferzellen - auch Primordium genannt), die, ausgehend von einer Plakode hinter der Ohranlage, entlang der gesamten Körperlänge des Fisches direkt unterhalb der Haut bis zur Schwanzspitze wandern (Abb. 2). Diese sensorischen Organe sind mit dem Nervensystem durch den Seitenliniennerv verbunden, der wiederum von Gliazellen ummantelt wird. Das Seitenlinienorgan stellt damit ein hervorragend geeignetes Modellsystem dar, um koordinierte Zellwanderungen während der Organentwicklung zu untersuchen.

Wir haben verschiedene Methoden entwickelt, die es erlauben, bestimmte Zellgruppen im lebenden Fischembryo mit fluoreszierenden Farbstoffen sichtbar zu machen. Damit lässt sich die Wanderung der verschiedenen beteiligten Zelltypen gleichzeitig im lebenden Fischembryo durch Multicolor-Zeitraffer-Analysen verfolgen. Dabei fanden wir, dass alle 3 Zelltypen synchron miteinander wandern. Unsere Experimente zeigen, dass die Gliazellen den Axonen folgen, während die Axone auch ohne Gliazellen ihren Weg finden [5]. Die Axone wiederum werden von der wandernden Plakode mitgezogen [1, 4]. Was sind die molekularen Grundlagen dieser Leitsignale und wie sichern diese die koordinierte Wanderung der verschiedenen Zelltypen des Seitenlinienorgans?

Markierung der wandernden Seitenlinien-Vorläuferzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen mit ClaudinB-GFP (cldnBGFP). Das obere Bild zeigt einen cldnBGFP exprimierenden transgenen Embryo im Alter von 38 Stunden nach Befruchtung. Das membranassozierte cldnBGFP wird in vielen von den Plakoden abstammenden Geweben exprimiert, z.B. in der Nase und im Ohr (siehe Pfeilspitzen im Kopfbereich). Das Primordium kann als sich bewegende Zellgruppe beobachtet werden, die immer wieder kleine Nester von Zellen absetzt, welche sich zu Neuromasten entwickeln werden (siehe Pfeile im Körperbereich). Die untere Aufnahme zeigt eine Nahaufnahme der wandernden Spitze des Primordiums.

Die Wanderung der Gliazellen im Seitenlinienorgan wird durch den ErbB-Signaltransduktionsweg koordiniert

Wir haben gezeigt, dass die Gliazellen den Axonen folgen [1]. Im bereits erwähnten Mutagenese-Experiment konnten wir eine Anzahl von Mutanten isolieren, bei denen die Glia-Vorläuferzellen nicht mit dem Seitenliniennerv wandern können. Die Klonierung der verantwortlichen und in den Mutanten defekten Gene zeigte, dass diese für die Neuregulin-Rezeptoren erbB3 und erbB2 kodieren [5]. Der Neuregulin-Stoffwechsel spielt in der Entwicklung einer Reihe menschlicher Krebsarten eine wichtige Rolle. Inhibitoren der ErbB-Rezeptoren können als mögliche Krebsmedikamente eingesetzt werden. Setzt man einen solchen Inhibitor beim Wildtyp-Zebrafisch ein, so sieht man, dass der ErbB-Stoffwechsel benötigt wird, um die Ko-Migration von Glia-Vorläuferzellen mit den wegweisenden Axonen sicher zu stellen (Abb. 3). Die beiden Rezeptoren werden von den Gliazellen hergestellt und befinden sich an deren Zelloberfläche. Sie reagieren auf Signale, die von den Axonen ausgesendet werden, und bewirken so, dass die Gliazellen stets in engstem Kontakt mit den Axonen bleiben [5].

Stopp der Gliazell-Wanderung durch Zugabe eines ErbB-Inhibitors. In der Abbildung ist in lebenden Fischembryonen der Seitenliniennerv in rot und das wandernde Primordium in grün markiert. Im oberen Bild sieht man einen unbehandelten Embryo, dabei umhüllen grüne Gliazell-Vorläufer (weißer Pfeil) fast den gesamtem Seitenliniennerv (rote Pfeilspitze). Im mittleren Bild wurde der Embryo mit ErbB-Inhibitor behandelt, bevor die Glia-Zellen gewandert sind, deshalb sind keine Gliazellen am Nerv zu finden. Im unteren Bild wurde ErbB-Inhibitor zu dem Zeitpunkt zugegeben, bei dem die Gliazellwanderung ca. zur Hälfe abgelaufen war (weiße Pfeilspitze). Dabei kommt die Gliazell-Wanderung bald zum Stillstand (weißer Pfeil), was zur Folge hat, dass der Seitenliniennerv nur zum Teil von Gliazellen umhüllt wird (rote Pfeilspitze).

Das Primordium folgt dem Chemokin SDF-1 und zieht den Nerv hinter sich her.

Zu unserer Überraschung fanden wir, dass in der oben beschriebenen Mutante „Odysseus“ [3], in der die Keimzellen ihren Weg nicht finden, auch die Plakodenwanderung betroffen ist. Cxcr4b wurde als das betroffene Gen identifiziert. Der Rezeptor, CXCR4b, wird in den Plakodenzellen exprimiert. Dieser Rezeptor erkennt, wie schon eingangs erläutert, den so genannten „stromal derived factor 1“ (SDF-1), der in Zellen entlang der Seitenlinie des Embryos hergestellt wird und den wandernden Zellen so ihren Weg weist. In mutanten Embryonen, in denen das Gen für den CXCR4-Rezeptor defekt ist, kann das Primordium nicht wandern. Auch die Axone wandern nicht. Um zu untersuchen, ob die Axone zu ihrer Wegfindung das gleiche Signalsystem wie das Primordium verwenden, wurden durch Zelltransplantationen Embryonen konstruiert, in denen mutante Axone mit normalen Primordien konfrontiert waren und umgekehrt. Wenn Wildtyp-Axone mit Cxcr4b-mutanten Primordiumzellen zusammengebracht wurden, wanderten sie nicht, jedoch konnten Cxcr4-mutante Axone in einem Wildtyp-Embryo ganz normal wandern. Damit konnten wir zeigen, dass die Wanderung des Nervs nicht direkt von CXCR4 gesteuert wird, sondern dem Weg des Primordiums folgt. Dies bedeutet also, dass das wandernde Primordium den Seitenliniennerv mit sich zieht. Die Wegfindung von Nerven erfolgt demnach in diesem Falle durch die Plakode, die im Übrigen an ihrer Spitze typische Suchbewegungen ausführt und in die das Axon eingebettet ist, sich quasi festhält (Abb. 4). Axonale Wegfindung durch eine sie begleitende Zellgruppe war zwar schon früher postuliert, ist aber hier am System des Seitenlinienorgans des Zebrafisches zum ersten Mal wirklich gezeigt worden [4].

Dieser neue Mechanismus („towing“), bei dem das wandernde Sinnesorgan-Primordium den Nerv, der es versorgen wird, hinter sich her zieht, bewirkt eine sichere und fehlerfreie Verbindung von Axon und Zielorgan auch im wachsenden Organismus.

Die Markierung des Seitenliniennervs mit DiD (rot) in cldnBGFP-transgenen Zebrafischembryonen (grün) zeigt, dass der Nerv, im Primordium eingebettet, den Weg findet und dass das Primordium vorauswandernd den wachsenden Nerv mit sich zieht. Das Bild links zeigt den Nerv allein, das Bild rechts zeigt die Doppelmarkierung mit GFP.

Originalveröffentlichungen

1.
Gilmour, D. T., H. M. Maischein, and C. Nüsslein-Volhard:
Migration and function of a glial subtype in the vertebrate peripheral nervous system.
Neuron 34, 577-588 (2002).
2.
Knaut, H., H. Steinbeisser, H. Schwarz, and C. Nüsslein-Volhard:
An evolutionary conserved region in the 3' UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish.
Current Biology 19, 454-466 (2002).
3.
Knaut, H., C. Werz, R. Geisler, and C. Nüsslein-Volhard:
A zebrafish homologue of the chemokine receptor Cxcr4 is a germ-cell guidance receptor.
Nature 421, 279-282 (2003).
4.
Gilmour, D., H. Knaut, H. M. Maischein, and C. Nüsslein-Volhard:
Towing of sensory axons by their migrating target cells in vivo.
Nature Neuroscience 7, 491-492 (2004).
5.
van Bebber, F.:
Neural crest mutants and the effect of glia during differentiation in the zebrafish (Danio rerio).
Dissertation, Eberhard-Karls-Universität Tübingen, (2005).
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