Funktion eines Kondensats bei der Regulierung der Transkription des Pluripotenzgens Sox2

Transkription wird durch Enhancer, Promotor und RNA-Polymerase reguliert

Die Regulierung der Genexpression ist entscheidend für die Entwicklung eines Embryos zu einem komplexen, erwachsenen Organismus. Der erste Schritt der Genregulation ist die Transkription, bei der die Informationen auf der DNA in mRNA umgeschrieben werden. In Eukaryoten ist die RNA-Polymerase II (Pol II) die zentrale molekulare Maschine der Transkription, die für die Synthese aller mRNAs zuständig ist. Die Promotorsequenz eines Gens ist wichtig für die Rekrutierung der Transkriptionsmaschinerie und die Aktivierung der Genexpression. Bei den meisten eukaryotischen Genen wird diese Rekrutierung nicht nur durch die Promotorsequenz, sondern auch durch distale DNA-Elemente, sogenannte Enhancer, gesteuert. Wie Enhancer, Promotor und Transkriptionsmaschinerie koordiniert werden, um eine präzise Gentranskription zu erreichen, ist eine noch weitgehend offene Frage.

Entdeckung von Transkriptionskondensaten

Unsere Abteilung befasst sich mit der RNA-Polymerase II. Wir verwenden dazu auf Einzelmolekülen basierende superauflösende in vivo Bildgebungsverfahren, um die räumlich-zeitliche Dynamik von Proteinclustern in lebenden Zellen und Geweben direkt zu untersuchen. Unser Labor entwickelte einen quantitativen Superauflösungsansatz für lebende Zellen, ein zeitkorreliertes PALM, "tcPALM", das zwei Arten von RNA-Polymerase II Clustern in lebenden embryonalen Stammzellen der Maus erkennen ließ. Bei einer handelt es sich um eine vorübergehende Clusterbildung mit einer kurzen Lebensdauer von wenigen Sekunden, bei der anderen um eine dauerhaftere, stabile Clusterbildung mit einer Lebensdauer von mehreren Minuten [1, 2]. Wir haben dadurch erstmals die Existenz von dynamischen Pol II Clustern in lebenden Zellen nachgewiesen und außerdem entdeckt, dass Pol II und Teile des Mediatorkomplexes in lebenden Zellen mit biomolekularen Kondensaten in Beugungsgröße assoziiert sind, welche wiederum mit Genen assoziiert sind, die von Super-Enhancern gesteuert werden [3, 4].

Kürzlich haben wir die superauflösenden Bildgebungsverfahren weiterentwickelt, um die Rolle von Kondensaten beim Super-Enhancer gesteuerten Gen-Bursting, einer gehäuften Genexpression in Schüben, zu untersuchen. Ein klassisches Beispiel ist das Sox2-Gen in embryonalen Stammzellen der Maus. Das Sox2-Gen ist ein wichtiges Pluripotenz-Gen, das die Stammzellfähigkeit der Zelle, also ihr Potenzial, sich in praktisch jeden anderen Zelltyp zu differenzieren, gewährleistet. Die gleichzeitige Bildgebung von Transkriptionskondensaten und neu entstehender mRNA des Gens Sox2 in einzelnen Zellen ergab in Echtzeit eine Anti-Korrelation zwischen dem Burst der entstehenden mRNA und dem Abstand zwischen Kondensat und Gen: Die Intensität des Bursts stieg nach einem "Kuss" zwischen dem Kondensat und dem Gen vom basalen Niveau an und nahm ab, sobald sich das Kondensat entfernte.

Der in Stammzellen aktive kanonische Sox2-Enhancer, die so genannte Sox2-Kontrollregion (SCR), ist eine distale Super-Enhancer-Region, die sich mehr als 100 kb stromabwärts des Genpromotors befindet. Die SCR ist für die ordnungsgemäße Regulierung der Sox2-Genexpression und die Homöostase der Stammzellen unerlässlich. Das Lehrbuchmodell würde vorhersagen, dass der Enhancer dynamisch Schlaufen bildet, um mit dem Genlokus zu interagieren, sodass die Intensität des Gen-Bursts mit dem Abstand zwischen Enhancer und Gen (anti-)korreliert wäre. Versuche, die Enhancer-Dynamik mit dem Gen-Bursting zu korrelieren, konnten diese Anti-Korrelation jedoch nicht zeigen. Da unser Ansatz eine Anti-Korrelation zwischen der Intensität des Gen-Bursts und dem Abstand zwischen Kondensat und Gen ergab, versuchten wir, die relative Dynamik aller drei Elemente direkt zu erfassen: Super-Enhancer, das burstende Gen und Kondensat in Echtzeit.

Unsere dreifarbige live-Bildgebung zeigte, dass der Sox2 Super-Enhancer und der Genlokus in einem Abstand von etwa 300 nm bleiben können, während sich die paarweisen Abstände der Kondensate, also Kondensat-zu-Gen und Kondensat-zu-Enhancer, erheblicher und in einer Weise ändern, die mit dem Bursting von Genen korreliert ist. Das Kondensat interagiert dynamisch und vorübergehend sowohl mit dem Enhancer als auch mit dem Genlokus, was wir als "Kuss"-Interaktionen bezeichnen. Bei einem Kuss zwischen dem Kondensat und dem Genlokus nimmt die Intensität des Sox2 mRNA Bursts zu, klingt dann aber ab, wenn sich das Kondensat entfernt (Abb. 1).

Die Interaktionen zwischen Enhancer und Promotor können durch Faktoren der Genomarchitektur, wie beispielsweise Cohesin, reguliert werden. Der Abbau einer Cohesin-Untereinheit entfernte das Kondensat weiter vom Gen und hob die Steigerung der Größe und Häufigkeit des Bursts auf. Cohesin scheint also auch für das Kondensat erforderlich zu sein, um das Bursting von Genen zu verstärken. Wir vermuten, dass Cohesin durch die Bildung von Chromatinschleifen das Kondensat zwar flüchtig, aber lange genug in die Nähe des Gens bringt und dort halten kann, um die Genexpression zu steigern. Störungen von Cohesin und lokalen cis-regulierenden Elementen verhindern nicht das basale Bursting, sondern beeinflussen das Kondensat und das verstärkte Gen-Bursting.

Eine Technologie, um unerforschte Fragen zu beantworten

Im Bereich der Genomorganisation sind die auf Konformationserfassung von Chromosomen basierenden Sequenzierungstechnologien derzeit die am häufigsten verwendeten Methoden zur Untersuchung von DNA-DNA-Interaktionen. Superaufgelöste Bildgebungsverfahren können dabei eine Schlüsselrolle bei der Aufklärung der Dynamik der Genomorganisation spielen. Unsere Arbeit unterstreicht die Bedeutung der gleichzeitigen Abbildung von Enhancer, Genlokus, Proteinkondensat und mRNA-Produkt in Echtzeit und mit hoher Empfindlichkeit. Es zeigt sich, dass das Kondensat ein wichtiger Faktor ist, der in früheren Studien nicht berücksichtigt wurde und ein besserer Prädiktor für das Bursting von Genen ist als der Abstand zwischen Enhancer und DNA.

Literaturhinweise