Forschungsbericht 2018 - Friedrich-Miescher-Laboratorium für biologische Arbeitsgruppen in der Max-Planck-Gesellschaft

Linked-read Sequenzierungstechnologie: Auf der Suche nach der Ursache genetisch bedingter Variation

Autoren
Dreau, Andreea; Venu, Vrinda; Gaspar, Ludmila; Jones, Felicity C.
Abteilungen
Arbeitsgruppe Molekulare Mechanismen von Anpassung und Speziation
Zusammenfassung
Genetische Variation ist die Grundlage der Biodiversität und das wichtigste Substrat der Evolution. Dazu untersuchen wir die Rolle der meiotischen Rekombination im Verlauf der Anpassung von Organismen an neue Umgebungen. Mithilfe einer von uns auf der linked-read Genomsequenzierungstechnologie basierenden Methode können wir individuelle Rekombinationsabläufe studieren und so deren molekulare Basis identifizieren. Die Daten werden unsere Kenntnisse über den Einfluss der meiotischen Rekombination auf die Evolution in natürlichen Populationen und über eine der Ursachen von Fehlgeburten erweitern.

Rekombination beeinflusst die Genomfunktion und Evolution

Die meiotische Rekombination, ein grundlegender biologischer Prozess bei allen sich geschlechtlich fortpflanzenden Arten, ist eine wichtige Quelle der genetischen Vielfalt mit erheblichen Auswirkungen auf die Genomfunktionen und den Prozess der Evolution. Während der Produktion der Gameten finden die jeweiligen Chromosomenpaare zueinander, und durch das sogenannte Crossover von DNA-Strängen werden die Allele innerhalb eines Elternteils vermischt, was zu zahlreichen neuen genetischen Kombinationen führt, die am Ende nach Befruchten der Eizelle an den Nachwuchs vererbt werden. Crossover bewirkt substantielles Verknüpfen als auch Auflösen von nützlichen und schädlichen Mutationen und hat allein dadurch schon große Auswirkungen auf den Phänotyp der Folgegeneration. Folglich beeinflusst die Rekombination das Überleben und die Geschwindigkeit, mit der sich natürliche Populationen entwickeln und sich an neue Umweltbedingungen anpassen.

Aufgrund dieser zentralen Rolle ist die molekulare Maschinerie, die der meiotischen Rekombination zugrunde liegt, im Tier- und Pflanzenreich hochkonserviert - was aber nicht bedeutet, dass sich die Rekombinationsereignisse ebenso gleichen. Die Variationen sind sehr vielfältig und es treten nicht selten Rekombinationsdefekte mit schwerwiegenden Folgen auf. Nicht lebensfähige Gameten oder Entwicklungsanomalien beispielsweise sind weit verbreitet, und beim Menschen bedingen meiotische Defekte mehr als 60 Prozent der Fehlgeburten in den ersten drei Schwangerschaftsmonaten. Auffallend ist, dass die Position und Häufigkeit des Auftretens von Rekombinations-Crossovers entlang eines Chromosoms variiert. Mit anderen Worten: Die Variationshäufigkeit schwankt innerhalb eines Genoms. Die Ursache dafür kennen wir nicht und die Identifizierung ihrer molekularen Basis stellt eine große Herausforderung dar.

Erstellung individualisierter genomischer Karten von Rekombinationsereignissen unter Verwendung der linked-read Sequenzierung

Abb. 1: Die ReMIX Methode erlaubt das schnelle Erkennen rekombinierter DNA in einzelnen Keimzellen bei gleichzeitiger Positionierung derjenigen Stellen im Chromosom, wo bestimmte Rekombinationen besonders häufig auftreten. Nähere Erläuterungen im Text.

Bis vor kurzem waren hochaufgelöste genomische Studien zur Variation von Rekombinationen bei Individuen zeitaufwändig und teuer. Eine dafür notwendige Anforderung ist nämlich die Möglichkeit, Haplotypen oder die Verknüpfung zwischen Allelen an Stellen von benachbarten Mutationen entlang des Genoms in den Gameten oder dem Nachwuchs eines Individuums nachvollziehen zu können. Dabei sucht man im Genom nach Positionen, an denen benachbarte Mutationen, die normalerweise zusammen vererbt werden, stattdessen an Mutationen aus dem gegenüberliegenden Chromosom angeheftet sind. Genau solche, durch Rekombinations-Crossovers verursachten Neuzusammensetzungen können verwendet werden, um genomweite Karten von Rekombinationsereignissen zu erstellen.

Mit der Unterstützung der Max-Planck-Gesellschaft und einer Förderung durch den Europäischen Forschungsrat (ERC) konnten wir die Vorteile der neuen, hochmodernen Genomsequenzierungstechnologie der Firma 10X Genomics nutzen, die die Produktion von Haplotyp gerechten linked-read Sequenzierungsdaten ermöglicht. Wir haben eine schnelle und kostengünstige Pipeline namens ReMIX entwickelt, die es ermöglicht, eine hochauflösende genomische Karte der Rekombinationsübergänge ein und desselben Individuums aus einem Pool von Gameten zu erstellen. Die Ergebnisse werden in Kürze von Dreau et al. veröffentlicht. Im Gegensatz zu herkömmlichen Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierungstechnologien erzeugt die linked-read Technologie längere und qualitativ hochwertige linked-read DNA-Sequenzen, die dazu geeignet sind, Rekombinations-Crossovers zu ermitteln. Aus einem Pool von Gameten identifiziert unsere Pipeline ReMIX diejenigen DNA-Abschnitte, die Rekombinations-Crossovers zwischen den jeweils beiden Chromosom-Haplotypen tragen und verwendet sie bei der Erstellung genomweiter Karten (Abb. 1). Unser leistungsstarker, hochdurchsatzstarker und kostengünstiger Ansatz zur Quantifizierung der Rekombinationsvariation im gesamten Genom eröffnet somit zahlreiche Möglichkeiten, die Rekombinationsvariation mit hoher genomischer Auflösung bei mehreren Individuen parallel zu untersuchen.

Untersuchung der Rekombination bei Labormäusen und natürlichen Populationen von Stichlingen

Um den Nutzen unseres Ansatzes zu demonstrieren, haben wir mit ReMIX eine Rekombinationskarte für eine einzelne männliche Maus erstellt. Im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Rekombinationskarten, die mittels teurer und zeitaufwendiger Zucht von über 1.500 jungen Mäusen erstellt wurden, erkennt ReMIX exakt die feinskaligen Rekombinationsvariationen und dazu Hotspots auf dem Maus-Chromosom Nr. 1 unter Verwendung einer einzigen männlichen Maus!

Aktuell verwenden wir unseren Ansatz bei der Untersuchung der Rekombinationsvariation in natürlichen Populationen von Stichlingen - einem Modellorganismus der evolutionären Genomik, der einen tiefen Einblick in die molekularen Grundlagen von Anpassung und Speziation ermöglicht [1]. Wir erstellen genomische Rekombinationskarten für eine Vielzahl von marinen, Süßwasser- und gemischten Hybrid-Stichlingen. Damit wollen wir die Mutationen und molekularen Grundlagen von Rekombinations-Hot- und Coldspots genetisch abbilden. Unsere Arbeit soll auch die Vermutung prüfen, ob die natürliche Selektion molekulare Mechanismen begünstigt, die die Rekombination zwischen verschiedenen Arten unterdrücken. Unsere Forschung wird weiterhin Aufschluss darüber geben, wie die meiotische Rekombination als Schlüsselquelle der genetischen Vielfalt den Fortpflanzungserfolg und das Überleben eines Individuums sowie die Anpassungsraten in natürlichen Populationen beeinflusst. Und unsere Forschung, die sich dem grundlegenden biologischen Prozess der Meiose und Rekombination widmet, könnte helfen zu verstehen, warum über die Hälfte der Fehlgeburten bis zum dritten Schwangerschaftsmonat schwerwiegende genetische Ursachen haben.

Literaturhinweise

1.
Jones, F. C.*; Grabherr, M. G.*; Chan, Y. F.*; Russell, P.*; Mauceli, E.; Zody, M. C.; Pirun, M.; Johnson, J.; White, S.; Birney, E.; Searle, S.; Schmutz, J.; Grimwood, J.; Dickson, M. C.; Myers, R. M.; Miller, C. T.; Summers, B. R.; Knecht, A. K.; Brady, S. D.; Zhang, H.; Pollen, A. A.; Howes, T.; Amemiya, C.; Broad Whole Genome Sequencing Platform and Whole Genome Assembly Team; Lander, E. S.; DiPalma, F.; Lindblad-Toh, K.; Kingsley, D. M.
The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks
Nature 484, 55-61 (2012)
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