Zebrafisch als Modellsystem

Die Zusammensetzung und Dynamik der Cajal Bodies (CB) in Zellen lebender Organismen sind noch nicht sehr gut erforscht. Um die Eigenschaften dieser Körper im Zellkern während der Prozesse von Zellwachstum und Zellteilung mit Hilfe von live-cell imaging genauer zu untersuchen, entwickelten die Wissenschaftler um Andy Oates und Karla Neugebauer den Zebrafisch-Embryo als Modellsystem.

In ihren Versuchen zeigt sich, dass Zebrafisch-Embryonen das Protein Coilin sowie mehrere Komponenten des prä-mRNA-Spleißprozesses enthalten. Die Cajal Bodies waren dabei sowohl vor als auch nach der Aktivierung der zygotischen Genexpression im Zellkern vorhanden. Das deutet darauf hin, dass die CB-Bausteine von mütterlicher Seite bereits mitgeliefert werden. Während der ersten 24 Stunden der Entwicklung wiesen die embryonalen Zellen bis zu 30 CBs pro Nukleus auf. Diese teilten sich vor der Mitose und formierten sich innerhalb von Minuten erneut bei der Bildung des Zellkerns in der Tochterzelle.

Die Unterteilung in Muskeln, Neuronen und Epidermis während der Embryonalentwicklung konnte mit einem stabilen Zustand von zwei CBs pro Zellkern in Verbindung gebracht werden. Die Forschergruppe vermutet, dass die Anzahl der CBs während der Entwicklung reguliert wird, um den Anforderungen der Genexpression in einem schnell wachsenden Embryo gerecht zu werden.

Cajal Bodies und Coilin

Es wird angenommen, dass Cajal Bodies eine Rolle in der Biogenese des RNA-Prozessierungskomplexes spielen. Wahrscheinlich findet man sie hochkonzentriert sowohl in den small Cajal body-spezifischen RNAs (scaRNA), die snRNA-Modifikationen anführen, in Faktoren des snRNP-Verbandes wie dem Survival-Motor-Neuron-Protein  (SMN) und auch in verschiedenen andere Komponenten.

Um makromolekulare Komplexe aus RNA und Proteinen, wie z. B. die Spleißosomen, zu erforschen, ist es wichtig, leicht manipulierbare experimentelle Systeme zu entwickeln, in denen Defekte der RNA-Proteinverbände starke Phänotypen hervorbringen. Cajal Bodies bilden ein gutes System zur Untersuchung der Funktion von RNA-Verbänden, weil ihre Verbindung größtenteils vom Coilin-Protein abhängt. Die Forscher des Max-Planck-Institutes konnten zeigen, dass Coilin sowohl für die Formation von CBs als auch für die Embryogenese im Zebrafisch benötigt wird.

Eine entscheidende Beobachtung ist, dass Morpholin-vermitteltes Coilin-Knockdown sowohl zum Verlust von Cajal Bodies in Zebrafischzellen, als auch zum Entwicklungsstop und Zelltod im 15- bis 16-Segment-Stadium im Fischembryo führt. Dies kann verhindert werden, indem Morpholin-resistente Coilin-mRNA gespritzt wird.

Das Forscherteam liefert drei Beobachtungen, die darauf hindeuten, dass die wichtigste Rolle der CBs im Zebrafisch in der Biogenese und Funktion der snRNPs liegt. Die entscheidende Beobachtung ist, dass die Injektion von reifen „vormontierten“ menschlichen snRNPs Wachstumsfehler von Coilin-Knockdown verhindern kann. Andere Experimente zeigen, dass bei einer Coilin-Funktionsstörung neu synthetisierte snRNAs fehlerhaft bei der Verbindung mit Sm-roteinen (Sm-Proteine – benannt nach einer Patientin Stephanie Smith – sind Bestandteile des Spleißosoms, welches die RNA bildet) sind, was wiederum auf einen Verbindungsdefekt hindeutet. Im gleichen Zug mit der eingeschränkten snRNP-Funktion resultiert der Coilin-Knockdown im Zebrafisch in einem Defekt im prä-mRNA-Spleißprozess. Dasselbe Resultat ist im Coilin-Knockdown in Säugetierzellkulturen zu beobachten.

Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass Coilin (und die Verbindung von Cajal bodies) snRNP-Verband und -funktion begünstigt, entweder durch die Förderung des finalen Reifeprozesses der snRNPs oder dadurch, dass Wechselbeziehungen zwischen individuellen snRNPs zur Bildung übergeordneter Komplexe ermöglicht werden.  Zum Beispiel schließen sich snRNPs zusammen und bilden das Spleißosom, wo RNA gebildet wird. In allen Fällen beweisen diese Studien, dass die Cajal bodies notwendig sind für den RNA-Bildungsprozess.

Cajal Bodies und small nuclear ribonuclein protein

Vieles, was heute über die molekulare Zusammensetzung von CBs bekannt ist, weiß man einerseits von konservierten, oft aneupliden Gewebekulturzellen einerseits und andererseits von CB-ähnlichen kugelförmigen Körperchen amphibischer Keimbläschen. Allerdings ist klar, dass keines der beiden Systeme eine allgemeingültige Sicht von CBs in diploiden somatischen Zellkernen darstellt. Zum Beispiel enthält das Keimbläschen beim Krallenfrosch (Xenopus Germinal Vesicle) bis zu 100 CBs mit einem Durchmesser zwischen 1-10 µm, während in den Zellkernen von Säugetier-, Pflanzen- und Drosophila-Zellen im Schnitt nur ein bis zwei CBs mit einem Durchmesser von 0,5-1 µm vorkommen.

Die CBs in allen diesen Organismen enthalten Bausteine des prä-mRNA-Spleißmechanismus. Andere Mechanismen variieren in der CB-Lokalisation. Zum Beispiel finden sich CBs an Histonloci und enthalten große Mengen an U7-snRNP, ein Faktor, der für die Bindung des 3’-Endes von Histon-mRNA benötigt wird. Auch CBs in Gewebekulturzellen von Säugetieren enthalten das U7-snRNP, welches mit den Histongenloci kolokalisiert. Beide Beobachtungen weisen daraufhin, dass CBs vielleicht einen aktiven RNA-Prozessierungsmechanismus besitzen.

Neueste Studien in Drosophila haben gezeigt, dass das U7-snRNP nicht in den CBs konzentriert ist, sondern in einem individuellen Zellkörper – dem Histon Locus Body (HLB). Dieser Zellkörper wird so benannt, weil er mit dem Histongenlocus kolokalisiert. Ähnliche Beobachtungen in menschlichen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) lassen darauf schließen, dass das Vorhandensein dieses speziellen RNA-Prozessierungsmechanismus in den CBs transformierter menschlicher Zellen das Krebsstadium widerspiegelt. Das warf die Frage auf, ob RNA-Prozessierungsmechanismen, die anfangs nur den CBs in ausgewählten Systemen zugeordnet wurden, normalerweise in allen Zellen und Organismen vorkommen.

Wie universell sind Cajal Bodies?

Die Bestandteile der CBs wechseln schnell mit dem Zellplasma, wo sie in zahlreiche molekulare Prozesse eingreifen. In den meisten somatischen Zellen (Körperzellen, aus denen keine Geschlechtszellen hervorgehen können) können sich die CBs im Zellplasma bewegen, teilen und neu formieren. Größe und Anzahl variieren während des gesamten Zellzyklus und können von post-translationalen Modifikationen des Coilin-Proteins beeinflusst werden. Mit diesem dynamischen Verhalten reagieren die Cajal Bodies auf die physiologischen Anforderungen lebender Zellen.

In Forschungen an Drosophila und Arabidopsis (Schaumkresse) wurde eine unterschiedliche Anzahl der Cajal Bodies in unterschiedlichen Zelltypen innerhalb eines Organismus festgestellt. In Arabidopsis wurde beobachtet, dass die CB-Anzahl pro Zellkern abhängig von Zelltyp und Entwicklungsstadium ist – ähnlich wie bei den Nährzellen von Drosophila. Jedoch scheinen somatische Zellen in Drosophila konstant nur einen CB pro Nukleus aufzuweisen. Es ist immer noch offen, ob dieser Zustand für alle tierischen Systeme gilt oder ob sich die CB-Anzahl während der Embryogenese verändern kann.

Die Forscher um Andy Oates und Karla Neugebauer nutzten die Vorteile der schnellen phänotypischen Entwicklung des Zebrafischembryos, um die CBs genauer zu untersuchen. Dieser Embryo eignet sich besonders für die Abbildung (Imaging) der Befruchtung. Es kann eine dynamische Beschreibung und detaillierte Analyse der CBs in einem lebenden Wirbeltiersystem realisiert werden (Abb. 1).

In allen Spezies, die bis heute erforscht wurden, sind die spliceosomalen snRNPs in den CBs gebündelt. Bevor das Coilin-Protein in einigen Arten entdeckt wurde, hielt man diese snRNPs für die Bona Fide Marker der Cajal Bodies. Aus diesem Grund hat sich das Team hier auf Zebrafisch-Coilin, spliceosomale snRNPs und U7-snRNP konzentriert. Bereits erzielte Forschungsergebnisse machen die molekulare Zusammensetzung und die dynamischen Besonderheiten der CBs während der Embryogenese bei Wirbeltieren deutlich. Darüber hinaus wird das System des Zebrafisch eingeführt, um zukünftig die Rolle der Zellarchitektur in einem Lebewesen zu erforschen.

Das Forscherteam fand heraus, dass die Zellkerne der Zebrafisch-Embryonen zahlreiche CBs der erwarteten Zusammensetzung enthalten, die sowohl eine schnelle Formierungs- und Auflösungsdynamik während der Mitose aufweisen als auch spezifische Veränderungen in der Anzahl entsprechend des Entwicklungsstadiums zeigen.

Die Anwendung zusätzlicher Hilfsmittel und Instrumente, wie z. B.  die Injektion von fluoreszenzmarkierten, in vitro transkribierten RNAs und die 3D-Rekonstruktion von Zellkernen, ließ einige Schlüsselergebnisse zu:

Erstens enthalten CBs im Zebrafisch keinen Prozessierungsmechanismus des Histon-mRNA-3’-Ende. Stattdessen ist er in verschiedenen Zellkörpern konzentriert.

Zweitens ist die Anzahl der Cajal Bodies pro Zellkern hochvariabel während der Embryogenese. Allerdings nähert sich die Anzahl asymptotisch auf zwei CBs pro Zellkern in differenzierten Zellen. Drittens sind die CBs in embryonalen Zebrafischzellen mit extrem kurzen Zellzykluszeiten (15 Minuten) hoch dynamisch. Bei jeder Zellteilung lösen sie sich auf, um sich dann sofort wieder neu zu verbinden.

Die Forscher liefern somit Beweise, dass die snRNP-Biogenese für die Integration der Cajal Bodies im Embryo notwendig ist.