Forschungsbericht 2010 - Max-Planck-Forschungsstelle für Enzymologie der Proteinfaltung
PDI-Chaperone und Substrat-Proteine in der Tumorpathogenese
PDI chaperones and client proteins in cancer pathogenesis
Autoren
Ferrari, David M.
Abteilungen
Max-Planck-Forschungsstelle für Enzymologie der Proteinfaltung, Halle
Zusammenfassung
Die Funktion von Proteinen im Endoplasmatischen Retikulum hat sich zu einem wichtigen Ziel in der pharmakologischen Forschung entwickelt. Hier findet die direkte Prozessierung von sekretorischen Proteinen statt, die mit verschiedenen Erkrankungen und Tumoren assoziiert sind, aber auch wichtige Schritte von Stress-Signalwegen in der Zelle beeinflussen; die u.a. zum Zelltod führen können. David M. Ferrari und sein Team haben das pharmakologische Potential der Peptidbindungsaktivität von Protein-Disulfid-Isomerasen erforscht und neue Inhibitorstoffe dieser Proteine identifiziert.
Summary
The function of proteins within the endoplasmic reticulum (ER) is becoming an important target in pharmacological research due to the direct involvement in processing of secretory proteins linked to disease and cancer and the indirect effects on cellular stress signalling and apoptosis. To investigate their potential as pharmaceutical targets, the team of David M. Ferrari has succeeded in elucidating the peptide binding properties of various Protein Disulfide Isomerases, and report on novel inhibitors that inhibit these interactions.
Sekretorische Proteine werden mit Hilfe von Chaperonen (Faltungshelfern), von denen einige zur Familie der Protein-Disulfid-Isomerasen (PDI) gehören, im Endoplasmatischen Retikulum (ER) gefaltet. Da diese Proteine mit Krankheiten assoziiert sein können, untersuchen die Wissenschaftler um David Ferrari Interaktionen zwischen den Proteinen. Um die Peptid-Bindung von PDI-verwandten Peptiden zu untersuchen, hat die Arbeitsgruppe von David Ferrari ein Chip-basiertes Microassay-System entwickelt und erfolgreich verwendet. So gelang es, die Frage nach der Bindung von Peptiden an über zwölf PDI-verwandten Proteinen und Proteinvarianten zu beantworten. Die sorgfältige Analyse des gesamten erhaltenen Datensets verlangte die Entwicklung und Zusammenstellung eines Software-Paketes, welches es ermöglichte, über fünf Millionen Kombinationen von Peptidbindungen zu vergleichen. Mit Hilfe des Software-Paketes (DiscoverY software suite) sind Ferrari und sein Team dabei, eine Datenbank aufzubauen, die verschiedene Interaktionen berücksichtigt: die Interaktion von PDI-verwandten Proteinen mit sekretorischen Proteinen, die der PDI-verwandten Proteinen miteinander und die Interaktion zwischen ER-Chaperonen.
Ferner können die Wissenschaftler Unterschiede in der Peptidbindungsaktivität von verschiedenen Spezies vergleichen. Es ist zu erwarten, dass diese umfassende Arbeit innerhalb der nächsten Monate abgeschlossen werden kann.
Identifizierung eines Peptidbindungs-Inhibitors für PDI-verwandte Proteine. (a) Die immobilisierte Inhibitorsubstanz Compound 1 (C1), bindet direkt an die PDI-verwandten Proteine (ERp57, P5, ERp29, weniger an ERp18). Gezeigt werden Western-Blot-Analysen von Protein-Eluaten. (b) C1 verhindert die Bindung von mehreren PDI-verwandten Proteinen an Peptide (auf Microchip-Arrays). (c) C1 beeinflusst nicht die Rückfaltung eines denaturierten, reduzierten Modellproteins (RNase). Der Rückfaltungsprozess ist Redox-abhängig. Die Rückfaltung des Proteins mit Hilfe von PDI und ERp57 wird durch die Zugabe von C1 nicht beeinflusst, die Rückfaltungskurve (entspricht der RNase-Aktivität) verändert sich nicht. (d) Eine zellgängige C1-ähnliche Substanz verringerte die Viabilität von kultivierten Fibroblasten konzentrationsabhängig. Der Effekt ist deutlicher in ERp29-defizienten Fibroblasten (weiße Säule) im Vergleich zu WT-Zellen (schwarze Säule). Dies deutete darauf hin, dass ERp29 eine der Hauptbindungskomponenten für den Inhibitor ist und dass der Effekt auf die Bindung von anderen PDI-verwandten Proteinen in der Abwesenheit von ERp29 größer ist.
Identifizierung eines Peptidbindungs-Inhibitors für PDI-verwandte Proteine. (a) Die immobilisierte Inhibitorsubstanz Compound 1 (C1), bindet direkt an die PDI-verwandten Proteine (ERp57, P5, ERp29, weniger an ERp18). Gezeigt werden Western-Blot-Analysen von Protein-Eluaten. (b) C1 verhindert die Bindung von mehreren PDI-verwandten Proteinen an Peptide (auf Microchip-Arrays). (c) C1 beeinflusst nicht die Rückfaltung eines denaturierten, reduzierten Modellproteins (RNase). Der Rückfaltungsprozess ist Redox-abhängig. Die Rückfaltung des Proteins mit Hilfe von PDI und ERp57 wird durch die Zugabe von C1 nicht beeinflusst, die Rückfaltungskurve (entspricht der RNase-Aktivität) verändert sich nicht. (d) Eine zellgängige C1-ähnliche Substanz verringerte die Viabilität von kultivierten Fibroblasten konzentrationsabhängig. Der Effekt ist deutlicher in ERp29-defizienten Fibroblasten (weiße Säule) im Vergleich zu WT-Zellen (schwarze Säule). Dies deutete darauf hin, dass ERp29 eine der Hauptbindungskomponenten für den Inhibitor ist und dass der Effekt auf die Bindung von anderen PDI-verwandten Proteinen in der Abwesenheit von ERp29 größer ist.
Weiterhin gilt das Interesse der Wissenschaftler aus Halle der Entwicklung von niedrigmolekularen Inhibitoren der PDI-Protein- und Peptid-Bindung. Einige solcher Inhibitoren wurden identifiziert. Für eine dieser Substanzen konnte bereits eine direkte Interaktion mit PDI-verwandten Proteinen nachgewiesen werden, ohne dass die Enzym-Redox-Eigenschaften beeinflusst wurden (Abb. 1). Die Daten zeigen, dass es mit Hilfe von spezifischen Inhibitoren möglich ist, die Peptid-Bindung von PDI-verwandten Proteinen zu blockieren, ohne ihre Redoxfunktion zu beeinflussen. Durch diese Inhibitoren werden auch das Zellwachstum und die Zellviabilität (Lebensfähigkeit) in einer von PDI-verwandten Proteinen abhängigen Art und Weise modifiziert. Die Arbeit zeigt somit deutlich, dass die Modulation der Chaperon-abhängigen Funktion von PDI-verwandten Proteinen ein wertvoller und valider Ansatz ist in der Erforschung von Tumor- und vielen weiteren Proteinfaltungs-Erkrankungen.
