Forschungsbericht 2010 - Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik

Die Stabilität von Bob1 in B-Zellen

Autoren

Nielsen, Peter

Abteilungen

Molekulare Immunologie (Reth)
Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik, Freiburg

Zusammenfassung

Bob1 (auch OBF-1 oder OCA-B genannt) ist ein lymphozytärer Transkriptionsfaktor. Während der Verlust von Bob1 die Reifung und Aktivierung von B-Zellen inhibiert, könnte eine Überexpression von Bob1 an der Entstehung von B-Zell-Lymphomen beteiligt sein. Die Regulation der Bob1-Proteinstabilität scheint ein wichtiger Mechanismus zu sein, über den B-Zellen die Menge an Bob1 regulieren. Wissenschaftler am Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik untersuchen, wie B-Zellen die Stabilität von Bob1 regulieren.

B-Zell-Entwicklung

Ein wichtiger Teil der Immunantwort besteht in der Fähigkeit, antigenspezifische Immunglobuline (Antikörper) zu produzieren. Die Quelle dieser Immunglobuline sind B-Zellen, die im Laufe des Lebens kontinuierlich aus hämatopoietischen Stammzellen in der fötalen Leber oder im adulten Knochenmark generiert werden. Es konnten verschiedene Stufen der B-Zell-Entwicklung identifiziert werden, unter anderem die Vorläufer-B-Zellen (pro- und prä-B-Zellen), reife B-Zellen (naive und ruhende B-Zellen), aktivierte Keimzentrums-B-Zellen, Gedächtnis-B-Zellen und Antikörper-produzierende Plasmazellen. Während neu produzierte (naive) B-Zellen eine relativ kurze Lebensdauer von einigen Tagen haben, besitzen Gedächtnis-B-Zellen eine Halbwertszeit von mehreren Monaten (Abb. 1).

Bob1- wichtig für die Entwicklung und Funktion von B-Zellen

Die Reifung von B-Zellen ist mit einer komplexen, aber geordneten Regulation der Genexpression verbunden. Hierbei spielen Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle. Es sind mehrere Beispiele bekannt, bei denen eine Mutation oder das Fehlen von Transkriptionsfaktoren zu einer fehlerhaften B-Zell-Entwicklung führen. Die Untersuchung des Immunsystems in solchen Mutanten liefert oft wichtige Hinweise auf die Funktion des betroffenen Transkriptionsfaktors.

Bob1 ist ein lymphozytärer Transkriptionsfaktor mit einer Masse von 34 kD. Bob1 bindet zusammen mit einem zweiten Transkriptionsfaktor (entweder Oct-1 oder Oct-2) an eine acht Nukleotide lange DNA-Sequenz (ATGCAAAT) und stimuliert die Transkription (Abb. 2).

Bob1 ist ein TranskriptionsfaktorBob1 bindet zusammen mit den Transkriptionsfaktoren Oct1 oder Oct2 an die Oktamer-Sequenz ATGCAAAT und stimuliert die Transkription. — **Bob1 ist ein Transkriptionsfaktor**Bob1 bindet zusammen mit den Transkriptionsfaktoren Oct1 oder Oct2 an die Oktamer-Sequenz ATGCAAAT und stimuliert die Transkription.

© Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik

**Bob1 ist ein Transkriptionsfaktor**Bob1 bindet zusammen mit den Transkriptionsfaktoren Oct1 oder Oct2 an die Oktamer-Sequenz ATGCAAAT und stimuliert die Transkription.

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Oft haben Gene, die für das Immunsystem wichtig sind, diese Oktamer-Sequenz im Promotor- oder Enhancer-Bereich (z. B. Gene für die leichten und schweren Ketten der Immunglobuline). Es konnte gezeigt werden, dass ein minimaler Promotor, bestehend aus einer TATA-Box und der Oktamer-Sequenz, ausreichend für eine lymphozytenspezifische Transkription ist. Mäuse mit einem defekten Bob1-Gen zeigen Störungen in der B-Zell-Entwicklung und -Funktion und sind immundefizient [1-3]. Ebenso wurden Veränderungen in der T-Zell-Funktion beobachtet [4]. Da Bob1 nur in B- und T-Zellen exprimiert ist, ist es verständlich, dass Defekte in anderen Geweben nicht auftreten. In Bob1-defekten Mäusen werden 2- bis 3-mal weniger B-Zellen produziert und die Aktivierbarkeit der B-Zellen ohne Bob1, zum Beispiel über deren B-Zell-Rezeptor, ist deutlich geringer. Eine Folge dieser B-Zell-Defekte ist eine stark reduzierte Antikörperproduktion nach Immunisierungen. Keimzentrums-B-Zellen fehlen völlig. In Menschen sind bisher keine funktionellen Mutationen von Bob1 beschrieben worden. Mehrere Versuche, Bob1-Mutationen in immundefizienten Patienten zu finden, blieben bis jetzt erfolglos.

Die Stabilität von Bob1

Es gibt Hinweise, dass die Menge von Bob1 einen wichtigen Einfluss auf die B-Zell-Entwicklung und -Funktion hat. Die Expression von Bob1 wird bereits in pro-B-Zellen beobachtet und bleibt während der ganzen B-Zell-Entwicklung erhalten. Während die Expression in pro-B- und reifen B-Zellen relativ niedrig ist, haben prä-B- und aktivierte Keimzentrums-B-Zellen deutlich höhere Mengen an Bob1. Wie oben erwähnt, scheint das Fehlen von Bob1 in der Maus die B-Zell-Entwicklung besonders in den prä-B- und Keimzentrums-B-Zellstadien zu inhibieren. Andererseits kann aber auch eine erhöhte und verfrühte Bob1-Expression die B-Zell-Entwicklung in der Maus stören [5]. Abnormale, erhöhte Bob1-Expression könnte auch an der Entstehung von bestimmten menschlichen B-Zell-Lymphomen beteiligt sein [6; 7]. Alle diese Beobachtungen sprechen dafür, dass B-Zellen die Menge an Bob1 genauestens regulieren müssen.

Wie aber wird die Menge des Bob1-Proteins reguliert? Obwohl Unterschiede in den Mengen an Bob1-mRNA in verschiedenen B-Zellarten vorkommen können, scheint der Hauptregulationsmechanismus der Bob1-Proteinmengen eher bei Änderungen der Proteinstabilität zu finden zu sein. Zum Beispiel haben aktivierte B-Zellen wesentlich mehr Bob1-Protein als ruhende B-Zellen, obwohl die mRNA-Menge nicht erhöht ist. Bob1 ist in der Regel ein kurzlebiges Protein und die Inhibition eines wichtigen Protein-Abbau-Systems der Zelle, des Ubiquitin/Proteasom-Systems, führt zur Stabilisierung von Bob1 [8; 9]. Es wurde auch beobachtet, dass die In-vitro-Stimulation von reifen B-Zellen über ihren B-Zell-Rezeptor ohne co-stimulatorische Signale zu einem Abbau von Bob1 (und zu einer Reduktion der Immunglobulin-Genexpression) führt. Vermutlich müssen zusätzliche, bis jetzt nicht identifizierte Signale dieser Destabilisierung entgegenwirken, wenn B-Zellen über ihren B-Zell-Rezeptor von Antigenen aktiviert werden.

Stabilität der ReporterproteineUm die Proteinstabilität zu untersuchen, wurden Gensequenzen eingesetzt, die gleichzeitig ein grün fluoreszierendes GFP-Bob1-Fusionsprotein und ein rot fluoreszierendes Tomato-Referenzprotein produzieren. In diesem Experiment wurde die für murines Bob1 kodierende cDNA an das 3’-Ende des offenen Leserasters von GFP fusioniert. Nach Transfektion in K46-B-Lymphomzellen aus der Maus und Kultivierung für 24 Stunden wurden die GFP- und Tomato-Signale mittels Durchflusszytometrie analysiert. K46-Zellen wurden mit Reporterplasmiden transfiziert, die unfusioniertes GFP (GFP, linke Grafik) oder ein GFP-Bob1-Fusionsprotein produzieren (GFP-Bob1, mittlere Grafik). Die rechte Grafik zeigt GFP-Bob1-Zellen, die für die letzten 20 Stunden der Kultivierung mit dem Proteasomen-Inhibitor MG132 inkubiert wurden. — **Stabilität der Reporterproteine**Um die Proteinstabilität zu untersuchen, wurden Gensequenzen eingesetzt, die gleichzeitig ein grün fluoreszierendes GFP-Bob1-Fusionsprotein und ein rot fluoreszierendes Tomato-Referenzprotein produzieren. In diesem Experiment wurde die für murines Bob1 kodierende cDNA an das 3’-Ende des offenen Leserasters von GFP fusioniert. Nach Transfektion in K46-B-Lymphomzellen aus der Maus und Kultivierung für 24 Stunden wurden die GFP- und Tomato-Signale mittels Durchflusszytometrie analysiert. K46-Zellen wurden mit Reporterplasmiden transfiziert, die unfusioniertes GFP (GFP, linke Grafik) oder ein GFP-Bob1-Fusionsprotein produzieren (GFP-Bob1, mittlere Grafik). Die rechte Grafik zeigt GFP-Bob1-Zellen, die für die letzten 20 Stunden der Kultivierung mit dem Proteasomen-Inhibitor MG132 inkubiert wurden.

© Max-Planck-Institut für Immunbiologie und Epigenetik

**Stabilität der Reporterproteine**Um die Proteinstabilität zu untersuchen, wurden Gensequenzen eingesetzt, die gleichzeitig ein grün fluoreszierendes GFP-Bob1-Fusionsprotein und ein rot fluoreszierendes Tomato-Referenzprotein produzieren. In diesem Experiment wurde die für murines Bob1 kodierende cDNA an das 3’-Ende des offenen Leserasters von GFP fusioniert. Nach Transfektion in K46-B-Lymphomzellen aus der Maus und Kultivierung für 24 Stunden wurden die GFP- und Tomato-Signale mittels Durchflusszytometrie analysiert. K46-Zellen wurden mit Reporterplasmiden transfiziert, die unfusioniertes GFP (GFP, linke Grafik) oder ein GFP-Bob1-Fusionsprotein produzieren (GFP-Bob1, mittlere Grafik). Die rechte Grafik zeigt GFP-Bob1-Zellen, die für die letzten 20 Stunden der Kultivierung mit dem Proteasomen-Inhibitor MG132 inkubiert wurden.

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Wie intrazelluläre Signalwege die Stabilität von Bob1 regulieren, bleibt weitgehend offen. Es wurde gezeigt, dass RING-Finger-enthaltende Komponenten des Ubiquitin-vermittelten Abbauweges Bob1 binden und destabilisieren können [8; 9]. Ob und wie deren Interaktion mit Bob1 reguliert wird, muss noch gezeigt werden. In der Arbeitsgruppe von Peter Nielsen wurde ein Reporterplasmid entwickelt, mit dem die Regulation der Bob1-Stabilität untersucht werden kann. Dieses Plasmid produziert ein bi-cistronisches mRNA-Transkript, von dem ein grün fluoreszierendes GFP-Bob1-Fusionsprotein und ein rot fluoreszierendes Referenzprotein („Tomato“) translatiert werden kann. Die Bestimmung der Fluoreszenzsignale in einzelnen Zellen ist mittels Durchflusszytometrie einfach, schnell und quantitativ durchzuführen. Veränderungen im Verhältnis zwischen GFP- und Tomato-Fluoreszenz für verschiedene GFP-Fusionsproteine geben einen Hinweis auf unterschiedliche Stabilitäten. Die Stabilität von GFP wird erheblich reduziert, wenn es mit Bob1 fusioniert wird, wobei das Fusionsprotein jedoch ebenso stabil ist wie das unfusionierte Bob1, wenn das Proteasom gehemmt wird (Abb. 3).

Ausblick

Unter anderem sollte es mit dem beschriebenen Reporterplasmid möglich sein, die Stabilität von Bob1 in verschiedenen Entwicklungsstadien oder nach Stimulation des B-Zell-Rezeptors zu messen. Auch können so die Bereiche in Bob1 selbst sowie mögliche weitere intrazelluläre Komponenten identifiziert werden, die für die Stabilitätsregulation wichtig sind. Um die B-Zell-Entwicklung und -Aktivierung besser zu verstehen, wird es nicht nur interessant sein zu wissen, wie die Bob1-Stabilität reguliert wird. Eine wichtige Frage ist auch, ob diese Regulation ein allgemeiner Mechanismus ist, der Proteinstabilität generell während der B-Zell-Entwicklung reguliert oder ob gezielt nur wenige Schlüsselproteine über ihre Stabilität reguliert werden.

D. B. Schubart, A. Rolink, M. H. Kosco-Vilbois, F. Botteri, P. Matthias:

B-cell-specific co-activator OBF-1/OCA-B/Bob1 required for immune response and germinal centre formation.

Nature 383, 538-542 (1996).

U. Kim, X-G. Qin, S. Gong, S. Stevens, Y. Luo, M. Nussenzweig, R.G. Roeder:

The B-cell-specific transcription co-activator OCA-B/OBF-1/Bob-1 is essential for normal production of immunoglobulin isotypes.

Nature 383, 542-547 (1996).

P. J. Nielsen, O. Georgiev, B. Lorenz, W. Schaffner:

B lmphoyctes are impaired in mice lacking transcriptional co-activator Bob1/OCA-B/OBF1.

European Journal of Immunology 26, 3214-3218 (1996).

C. Brunner, A. Sindrilaru, I. Girkontaite, K.-D. Fischer, C. Sunderkötter, T. Wirth:

BOB.1/OBF.1 controls the balance of TH1 and TH2 immune responses.

The EMBO Journal 26, 1-12 (2007).

Bordon, N. Bosco, C. DuRoure, B. Bartholdy, H. Kohler, G. Matthias, A. G. Rolink, P. Matthias:

Enforced expression of the transcriptional coactivator OBF1 impairs B cell differentiation at the earliest stage of development.

PLoS One 3, 1-16 (2008).

R. L. Auer, J. Starczynski, S. McElwaine, F. Bertoni, A. C. Newland, C. D. Fegan, F.E. Cotter:

Identification of a potential role for POU2AFI and BTG4 in the deletion of 11q23 in chronic lymphocytic leukemia.

Genes, Chromosomes & Cancer 43, 1-10 (2005).

C. Zhao, J. Inoue, I. Imoto, T. Otsuki, S. Iida, R. Ueda, J. Inazawa:

POU2AF1, an amplification target at 11q23, promotes growth of multiple myeloma cells by directly regulating expression of a B-cell maturation factor, TNFRSF17.

Oncogene 27, 63-75 (2008).

R. Tiedt, B.A. Bartholdy, G. Matthias, J. W. Newell, P. Matthias:

The RING finger protein Siah-1 regulates the level of the transcriptional co-activator OBF-1.

The EMBO Journal 20, 4143-4152 (2001).

J. Boehm. Y. He. A. Greiner. L. Staudt und T. Wirth:

Regulation of BOB.1/OBF.1 stability by SIAH.

The EMBO Journal 20, 4153-4162 (2001).