Forschungsbericht 2018 - Max-Planck-Institut für molekulare Genetik

Identifikation von Biomarkern für die Sensitivität gegenüber EGFR-Inhibitoren durch molekulare Analyse von kolorektalen Karzinomen in präklinischen Modellen

Autoren
Risch, Thomas; Abdavi-Azar, Nilofar; Jandrasits, Christine; Amstislavskiy, Vyacheslav; Worth, Catherine L.; Warnatz, Hans-Jörg; Sultan, Marc; Herwig, Ralf; Lehrach, Hans; Yaspo, Marie-Laure; in Kooperation mit dem OncoTrack Konsortium (www.oncotrack.eu)
Abteilungen
Vertebraten-Genomik
Zusammenfassung
Kolorektale Karzinome (CRC) sind klinisch anspruchsvolle Tumore. Um neue, prädiktive Biomarker zu identifizieren, rekrutierte das OncoTrack-Konsortium 106 CRC-Patienten und erstellte eine Biobank von Organoid- und Xenograft-Modellen, die molekular und in ihrer Reaktion auf Therapie analysiert wurden - eine einzigartige Ressource, um unser Verständnis von CRC zu verbessern. Durch Verknüpfung molekularer Muster mit Therapieeffekten wurden neue Biomarker einschließlich einer Signatur identifiziert, die RAS/RAF-Mutationen in der Vorhersage der Empfindlichkeit gegenüber EGFR-Inhibitor übertraf.

Einleitung

Krebs ist eine Erkrankung des Genoms, die zu einem Verlust der Kontrolle über das Zellwachstum führt. Tumore zeigen komplexe molekulare Veränderungen des Genoms, des Epigenoms und des Transkriptoms. Mittels detaillierter molekularer Analysen individueller Tumore im Sinne einer Präzisionsonkologie können spezifische Änderungen identifiziert werden, die Rückschlüsse auf die Erfolgsaussichten, Resistenz und Nebenwirkungen von Therapien für die Patienten erlauben. So können Resultate aus der Grundlagenforschung direkt in translationale Medizin übersetzt werden.

Kolorektale Karzinome (colorectal carcinoma, CRC) sind die weltweit dritthäufigste Krebsart und eine klinische Herausforderung. Sie stellen eine komplexe Erkrankung dar, die gewöhnlich durch eine Mutation im APC-Gen in Darmpolypen initiiert wird, was Chromosomeninstabilität und weitere Mutationen fördert, die dann zu einer Deregulierung der WNT-, MAPK- und EGFR-Signalwege führen [1]. Nur ein Bruchteil der CRCs reagiert auf Chemotherapie, und Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), wie zum Beispiel Cetuximab, werden nur bei Tumoren angewendet, die keine Mutation in BRAF oder RAS zeigen [2, 3]. Aktuell gibt es keine direkten, prädiktiven Marker zur Identifizierung von Patienten, die auf Cetuximab-Behandlung ansprechen. Für die Identifizierung neuer Biomarker ist daher ein besseres Verständnis der molekularen Vorgänge bei CRC dringend erforderlich.

Entwicklung und molekulare Charakterisierung einer präklinischen Plattform für CRC

Das Projekt OncoTrack‚ gefördert durch die Innovative Medicines Initiative (IMI), ein private-public partnership zwischen der EU und der EFPIA (Europäische Vereinigung der Pharmazeutischen Industrie), zielt darauf, die medikamentöse Behandlung von CRC zu verbessern (Abb. 1). Mehr als 100 CRC-Patienten in den Krankheitsstadien I bis IV wurden rekrutiert und eine Biobank der Ursprungstumore sowie daraus abgeleiteter in vivo- und in vitro-Modelle (Xenograft- und Organoidmodelle) erstellt. Davon ausgehend wurde der Zusammenhang zwischen den molekularen Eigenschaften von CRC und der Arzneimittelwirksamkeit von 16 Wirkstoffen untersucht [4]. Alle Proben wurden durch Genom-, Exom- und Transkriptomsequenzierung (RNAseq) sowie durch Proteom-Analyseverfahren molekular charakterisiert. RNA-seq war von besonderer Bedeutung, weil eine Deregulierung der Genexpression oder eine pathologische RNA-Prozessierung nur über die Determinierung von mRNAs identifiziert werden können. RNA-seq dient nicht nur zum Auslesen der im Tumor aktiven biologischen Prozesse, sondern hilft auch, die häufigsten Zelltypen in den CRC-Untergruppen und der Mikroumgebung der Tumore zu identifizieren.

original
Abb. 1: Übersicht über die OncoTrack-Studie. (a) Experimenteller Aufbau der Studie. (b) Vergleichende molekulare Analysen. Oberer Teil: Anteil an unterschiedlichen Mutationen in Patiententumoren und Modellen. Unterer Teil: Transkriptomische Analysen der Patiententumore, Xenograft- und Organoidmodelle. Genexpressionsanalysen sind mit einem graduierten Farbverlauf (rot – viel Genexpression und blau – geringere Genexpression) dargestellt. (c) Identifikation von Biomarkern für Cetuximab-Sensitivität. Oberer Teil: Vergleich der Leistungsfähigkeit der Vorhersage von Cetuximab-Sensitivität, basierend auf dem Mutationsstatus von KRAS, BRAF, NRAS und dem Mini-Klassifikator. Unterer Teil: Die Hauptkomponentenanalyse (links) zeigt die Aufteilung von Respondern und Non-Respondern, basierend auf dem Mini-Klassifikator in Xenograft-Modellen und die vorhergesagte Cetuximab-Reaktion der Patiententumore in den drei molekularen Hauptgruppen (rechts).

Im Allgemeinen stimmte das genetische Profil der Modelle mit dem der Ursprungstumore überein und wies das typische CRC-Mutationsmuster auf [5]. Jedoch zeigten sich in einigen Modellen signifikante Unterschiede, die der Intratumor-Heterogenität (ITH) zugeschrieben werden können. Einige Mutationsunterschiede können für die Vorhersage von Arzneimittelwirkungen herangezogen werden, zum Beispiel eine Mutation in EGFR, die eine Anfälligkeit für EGFR-Inhibitoren hervorrufen kann. Daher wäre es sinnvoll, für jeden Patienten mehrere Modelle zu erstellen, um die Gesamtheit eines Tumors erfassen zu können.

Die bemerkenswertesten Unterschiede zwischen den Ursprungstumoren und den Modellen zeigten sich in den Genexpressionsprofilen (RNA-seq). Mittels bioinformatischer Analysen der RNA-seq-Daten konnten die CRCs in drei Hauptkategorien eingeteilt werden: ASCL2/MYC mit erhöhter Expression von ASCL2, dem Hauptregulator der Kryptenstammzellen, Entero/Goblets mit Merkmalen von epithelialen Enterozyten, endokrinen und GobletZellen, sowie ECM/EMT mit hochaktiven TGFβ- Signalwegen, die auch Marker für extrazelluläre Matrix (ECM), Immunzellen und Epithel-zu-Mesenchym-Transition (EMT) aufweisen. Die Tumormodelle hingegen bestehen fast ausschließlich aus Tumorzellen und ließen sich nur in zwei Gruppen einteilen: eine mit Stammzell-Eigenschaften, die andere mit Eigenschaften spezialisierter darmtypischer Zellen aufgrund des Verlustes der humanen Tumor-Mikroumgebung. Dies erleichtert es, molekulare Profile mit der Reaktion auf Therapien zu korrelieren.

Neue Biomarker für Darmkrebsmedikamente

Wir haben die Reaktion von ungefähr 100 Modellen auf eine Reihe von Medikamenten analysiert. Trotz grundlegender biologischer Unterschiede zwischen den in vivo und in vitro Modellen wiesen die Ergebnisse bei beiden Modellen den gleichen Trend auf, obwohl sie nicht vollständig übereinstimmten.

Um neue Biomarker zu erhalten, wurden differentielle Genexpressionsanalysen zwischen Respondern und Non-Respondern durchgeführt. Dieser korrelative Ansatz war besonders erfolgreich für EGFR-Inhibitoren. Respondermodelle, die auf die EGFR-Blockade reagierten, zeigten Expression von Stemness- und Wnt-Signaturen, während die resistenten Modelle epitheliale Marker exprimierten. Darauf aufbauend wurde mittels eines bioinformatischen Ansatzes, der rekursive Eliminierung von Merkmalen und SVM-Algorithmen kombiniert, ein Mini-Klassifikator von 16 Genen identifiziert, der Cetuximab-Responder von Non-Respondern trennt. Die Vorhersagen dieses Klassifikators wurden an zusätzlichen CRC-Xenograft- und menschlichen Kohorten validiert. So konnten wir zeigen, dass dieser den BRAF/RAS Status bei der Vorhersage der Cetuximab-Reaktion übertraf. Am besten reagierten Tumore der ASCL2/MYC-Gruppe auf diese Medikamente. Somit konnten zum ersten Mal molekulare CRC-Gruppen mit klinischer Wirksamkeit eines Medikaments korreliert werden.

Die OncoTrack Studie hat eine große Daten- und Materialsammlung etabliert, die für eine verbesserte Wirkstoffforschung und zum Verständnis der Biologie von Darmkrebs weiter genutzt werden kann. Insbesondere die integrative Analyse der molekularen Zusammensetzung jedes Tumors und Modells wird aufgrund der enormen Fortschritte bei den neuen Sequenzierverfahren und Datenanalysemethoden zu einem realisierbaren Paradigma.

Literaturhinweise

1.
Zhang, L.; Shay, J.W.
Multiple roles of APC and its therapeutic implications in colorectal cancer
Journal of the National Cancer Institute 109, djw332 (2017)
DOI
2.
Van Cutsem, E.; Köhne, C.H.; Láng, I.; Folprecht, G.; Nowacki, M.P.; Cascinu, S.; Shchepotin, I.; Maurel, J.; Cunningham, D.; Tejpar, S.; Schlichting, M.; Zubel, A.; Celik, I.; Rougier, P.; Ciardiello, F.
Cetuximab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: updated analysis of overall survival according to tumor KRAS and BRAF mutation status
Journal of Clinical Oncology 29, 2011-2019 (2011)
DOI
3.
Bertotti, A.; Papp, E.; Jones, S.; Adleff, V.; Anagnostou, V.; Lupo, B.; Sausen, M.; Phallen, J.; Hruban, C.A.; Tokheim, C.; Niknafs, N.; Nesselbush, M.; Lytle, K.; Sassi, F.; Cottino, F.; Migliardi, G.; Zanella, E.R.; Ribero, D.; Russolillo, N.; Mellano, A.; Muratore, A.; Paraluppi, G.; Salizzoni, M.; Marsoni, S.; Kragh, M.; Lantto, J.; Cassingena, A.; Li, Q.K.; Karchin, R.; Scharpf, R.; Sartore-Bianchi, A.; Siena, S.; Diaz, L.A. Jr.; Trusolino, L.; Velculescu, V.E.
The genomic landscape of response to EGFR blockade in colorectal cancer
Nature 526, 263-267 (2015)
DOI
4.
Schütte, M.; Risch, T.; Abdavi-Azar, N.; Boehnke, K.; Schumacher, D.;  Keil, M.; Yildiriman, R.; Jandrasits, C.; Borodina, T.; Amstislavskiy, V.; Worth, C.L.; Schweiger, C.; Liebs, S.; Lange, M.; Warnatz, H.J.; Butcher, L.M.; Barrett, J.E.; Sultan, M.; Wierling, C.; Golob-Schwarzl, N; Lax, S.; Uranitsch, S.; Becker, M.; Welte, Y.; Regan, J.L.; Silvestrov, M.; Kehler, I.; Fusi, A.; Kessler, T.; Herwig, R.; Landegren, U.; Wienke, D.; Nilsson, M.; Velasco, J.A.; Garin-Chesa, P.; Reinhard, C.; Beck, S.; Schäfer, R.; Regenbrecht, C.R.; Henderson, D.; Lange, B.; Haybaeck, J.; Keilholz, U.; Hoffmann, J.; Lehrach, H.; Yaspo, M.L.
Molecular dissection of colorectal cancer in pre-clinical models identifies biomarkers predicting sensitivity to EGFR inhibitors
Nature Communications 8: 14262 (2017)
DOI
5.
Cancer Genome Atlas Network (326 Autoren)
Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer
Nature 487, 330-337 (2012)
DOI
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