Forschungsbericht 2017 - Max-Planck-Institut für Biophysik

Struktur der dimeren ATP-Synthase aus der inneren Mitochondrienmembran einer Hefe

Autoren
Hahn, Alexander; Parey, Kristian; Bublitz, Maike; Mills, Deryck J.; Zickermann, Volker; Vonck, Janet; Kühlbrandt, Werner; Meier, Thomas
Abteilungen
Strukturbiologie
Zusammenfassung
Die vollständige Struktur der dimeren F1Fo-ATP-Synthase aus Mitochondrien der Hefe Yarrowia lipolytica wurde mittels einer Kombination von cryo-Elektronenmikroskopie (cryo-EM) und Röntgenkristallographie aufgeklärt. Die Struktur zeigt 58 der 60 Untereinheiten im dimeren Komplex. Horizontale Helices der Untereinheit a im Fo- Subkomplex legen sich um den c-Ring-Rotor. Insgesamt sechs senkrechte Helices durchspannen die Membran. Unsere Strukturuntersuchung erklärt die strukturelle Basis der Cristae-Bildung in Mitochondrien, ein wichtiger morphologischer Aspekt eukaryotischer Zellen.

Einleitung

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Abb. 1: Cryo-EM Struktur des ATP-Synthase-Dimers der Hefe Yarrowia lipolytica. (A) Seitenansicht der EM-Karte (grau). In das Monomer rechts wurde die Röntgenstruktur des F1c10-Komplexes derselben ATP-Synthase und ein Homologiemodell des peripheren Stators eingepasst. Die Schnittebenen und Blickrichtungen von B bis D sind in A angezeigt. (B, C) Detaillierte Ansichten der Interaktionen der peripheren Stator-Untereinheiten wie in (A) gezeigt; (B) und (C) zeigen Detailansichten. α-Untereinheit dunkelgrün; β-Untereinheit hellgrün; Untereinheit a hellblau; c10-Ring gelb; Untereinheiten: γ blau, δ türkis, e hellgrau, b lila, d orange, h lachsfarben, OSCP (oligomycin sensitivity-conferring protein) rot. (D) Das Inhibitor-Protein IF1 (intrinsic inhibitor protein, hellblau) bindet an der αβDP-Seite, die sich in unmittelbarer Nähe des Stators befindet. Die durchschnittliche Auflösung des Modells von 7,8 Å in (A) wurde durch Maskierung auf 6,9 Å für den F1 Komplex verbessert (B bis D). Referenz [4] enthält ein Video des kompletten ATP-Synthase-Dimers.

ATP-Synthasen sind ein zentraler Bestandteil des Energiestoffwechsels in den Mitochondrien, den Kraftwerken der Zelle. ATP-Synthasen erzeugen Adenosintriphosphat (ATP), die Energiespeicherform der Zelle, indem sie einen elektrochemischen Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran umsetzen. Der Protonengradient treibt die Rotation eines Rings aus 10 c-Untereinheiten (c10-Ring) im Fo-Komplex. Die Energie des Gradienten wird über die Rotation des Rings im F1-Komplex zur Synthese von ATP verwendet (Rotationskatalyse). Mitochondriale F1Fo-ATP-Synthasen spielen eine zentrale Rolle im zellulären Energiehaushalt und sind auch an der Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt [1]. In Mitochondrien der Hefe sowie in Säugetieren bilden ATP-Synthasen Dimere, wobei die beiden Monomere fast senkrecht zueinander stehen. Dies bewirkt eine lokale Krümmung der inneren Mitochondrienmembran und führt zu einer spontanen Ausbildung von Dimer-Reihen. Auf diese Weise vermitteltn ATP-Synthasen in der inneren Mitochondrienmembran die Bildung der Cristae [2]. Einen Überblick gibt der Artikel von Kühlbrandt und Davies [3]. Abbildung 1A zeigt die elektronenmikroskopische Dichtekarte des ATP-Synthase-Dimers. In die Dichte des rechten Monomers wurde die Röntgenkristallstruktur des F1/c-Ring Komplexes eingepasst.

Ergebnisse

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Abb. 2: Die Stator-Region der F1Fo-ATP-Synthase. (A) Blick von der Matrix und (B) Blick von der Membran. Vier horizontale und sechs vertikale Helices (1 bis 6) in Nachbarschaft zum c10-Ring-Rotor (gelb) innerhalb der Detergentienmicelle (grau) bilden die Stator-Untereinheiten. Untereinheiten: a (blau), b (lila), 8 (grün), f (lavendel), i (dunkelorange). (C) Mit Hilfe der cryo-EM Dichtekarte sowie Sequenzvergleichen und Strukturinformationen homologer Proteine konnte ein komplettes Model des peripheren Stators, bestehend aus den Untereinheiten OSCP, d, h, b, 8, f und i sowie der Protonen transportierenden Untereinheit a erstellt werden.

In der Arbeitsgruppe von Thomas Meier der Abteilung Strukturbiologie wurde die Gesamtstruktur der dimeren ATP-Synthase der Hefe Yarrowia lipolytica mithilfe der cryo-Elektronenmikroskopie untersucht [4] und mit einer Auflösung von 6,1 Å bestimmt. Die Bereiche der katalytischen F1-Region sowie des c-Ring-Rotors konnten durch eine 3,5 Å-Röntgenkristallstruktur ergänzt werden (Kristian Parey, Brookhaven Datenbank pdb-ID: 5FL7 [5]).

Mittels Massenspektrometrie und ATP-Hydrolyse-Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass das für die cryo-Elektronemikroskopie (Abb. 1A) isolierte ATP-Synthase-Dimer das vollständige Ensemble aller Proteinuntereinheiten enthält und enzymatisch aktiv ist. Durch eine Klassifizierung der cryo-EM Daten konnten im katalytischen F1-Komplex (grün) drei verschiedene Rotationszustände beobachtet werden. Bei jeder Drehung des Rotors um 120 Grad entsteht ein Molekül ATP aus ADP (Adenosindiphosphat) und Phosphat.

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Abb. 3: Protonentranslokation durch Fo. (A) Innermembranraum (Lumen, IMS)-Oberfläche im Yarrowia lipolytica ATP-Synthase Dimer. Die Farben der Untereinheiten entsprechen denen in Abbildung 1. Weitere Erläuterungen zu den Teilabbildungen B, C und D im Text.

In der elektronenmikroskopisch bestimmten Struktur des Dimers konnten entsprechende Dichtebereiche mit zwei Ausnahmen allen Untereinheiten zugeordnet werden (Abb. 2).

Protonentranslokation durch Fo

Die Protonentranslokation durch Fo wird durch die Untereinheit a und durch den c-Ring vermittelt (Abb. 3).

In Abbildung 3A erkennt man, dass der c-Ring und ein Teil der Untereinheit a in Kontakt mit der wässrigen Umgebung stehen, da konservierte Aminosäure-Reste in der horizontalen Helix aH5 der Untereinheit a (hellblau) von der IMS-Seite (IMS: intermembrane space) sichtbar sind. Dies ist der Protonen-Eingangskanal im Fo-Komplex. In der Schrägansicht von der Matrix (B) ist ein Hohlraum zwischen c-Ring (gelb) und Untereinheit a (hellblau) sichtbar, der durch hydrophile und polare Aminosäuren der Untereinheit a gebildet wird. Der Hohlraum bildet den Ausgangsbereich des Protonenkanals. Im Horizontalschnitt des Modells (C und D) zeigen die gestrichelten Pfeile den Protonenwanderungspfad von der IMS (P-Seite) zur Matrix (N-Seite), wie er bereits für die ATP-Synthase von Polytomella sp. von Allegretti vorgeschlagen wurde [6].

Kontaktstelle zwischen zwei Monomeren

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Abb. 4: Membranproteindichten in den zwei Fo-Stator-Komplexen im Yarrowia lipolytica ATP-Synthase-Dimer. Untereinheiten a, b, f, i und 8 sind wie in Abbildung 1 gefärbt, die Untereinheiten e und g gelbweiß. (A) Seitenansicht der dimeren Grenzfläche. Die Fo-Untereinheiten der zwei ATP-Synthase-Monomere interagieren auf der IMS-Seite. (B) Ansicht von der IMS-Seite aus. Das C-terminale Segment der Untereinheit f vermittelt den direkten Kontakt zwischen den beiden Monomeren im Dimer. Die Dichten auf jeder Seite des Proteinkontakts werden den Untereinheiten e und g zugeordnet. (C) Blick vom c-Ring. (D) Schrägansicht von (A).

Der direkte Kontakt zwischen zwei ATP-Synthase-Monomeren wird durch die Untereinheit f vermittelt (Abb. 4). Die Untereinheiten e und g befinden sich an der Peripherie der Dimerisierungs-Schnittstelle und bilden keine erkennbaren direkten Dimer-Kontakte aus. Viel mehr besteht ihre Funktion darin, eine hohe lokale Krümmung der inneren mitochondrialen Membran herbeizuführen und dadurch die Dimerisierung und die Bildung langer Dimer-Reihen zu befördern, die den mitochondrialen Cristae ihre charakteristische Form verleihen.

Anhand der hier vorgestellten Daten konnte am Beispiel der ATP-Synthase der Hefe Yarrowia lipolytica gezeigt werden, wie sich deren dimere Struktur in der inneren Membran der Mitochondrien anordnet. Außerdem bietet die Struktur einen detaillierten Einblick in den Mechanismus des Protonentransports. Die Oberflächenvergrößerung der mitochondrialen Innenmembran durch Ausbildung der Cristae bietet einer größeren Anzahl von Komplexen der Atmungskette Platz, die für den erhöhten Energiebedarf eukaryotischer Lebewesen notwendig ist [7].

Literaturhinweise

1.
Kucharczyk, R.; Zick, M.; Bietenhader, M.; Rak, M.; Couplan, E.; Blondel, M.; Caubet, S. D.; di Rago, J. P.
Mitochondrial ATP synthase disorders: molecular mechanisms and the quest for curative therapeutic approaches
Biochimica et Biophysica Acta 1793, 186–199 (2009)
2.
Davies, K. M.; Anselmi, C.; Wittig, I.; Faraldo-Gómez, J. D.; Kühlbrandt, W.
Structure of the yeast F1Fo-ATP synthase dimer and its role in shaping the mitochondrial cristae
Proceedings of the National Academy of Sciences USA 109, 13602-13607 (2012)
3.
Kühlbrandt, W.; Davies, K. M.
Rotary ATPases: a new twist to an ancient machine
Trends in Biochemical Sciences 41, 106-116 (2016)
4.
Hahn, A.; Parey, K.; Bublitz, M.; Mills, D. J.; Zickermann, V.; Vonck, J.; Kühlbrandt, W.; Meier, T.
Structure of a complete ATP synthase dimer reveals the molecular basis of inner mitochondrial membrane morphology
Molecular Cell 63, 445-456 (2016)
5.
Berman, H. M.; Westbrook, J.; Feng, Z.; Gilliland, G.; Bhat, T. N.; Weissig, H.; Shindyalov, I. N.; Bourne, P. E.
Brookhaven-Protein Data Bank
Nucleic Acids Research 28, 235-242 (2000)
6.
Allegretti, M.; Klusch, N.; Mills, D. J.; Vonck, J.; Kühlbrandt, W.; Davies, K. M.
Horizontal membrane-intrinsic α-helices in the stator a-subunit of an F-type ATP synthase
Nature 521, 237-240 (2015)
7.
Lane, N.; Martin, W.
The energetics of genome complexity
Nature 467, 929–934 (2010)
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