Forschungsbericht 2017 - Max-Planck-Institut für marine Mikrobiologie

Verdauungsenzyme im Ozean und im menschlichen Darm

Autoren
Hehemann, Jan-Hendrik; Schlösser, Manfred
Abteilungen
MARUM MPG Brückengruppe Marine Glykobiologie
Zusammenfassung
Die Forschungsgruppe Marine Glykobiologie studiert den mikrobiellen Abbau organischer Materie, die von marinen Algen gebildet wird. Diese wandeln große Mengen von Kohlenstoffdioxid mithilfe von Licht und Wasser in Zucker um und bilden auf diese Weise die Nahrung für heterotrophe Organismen. Global betrachtet, bilden marine Algen durch Photosynthese die gleichen Mengen an reduziertem Kohlenstoff wie die gesamte Biomasse der Landpflanzen. Und nebenbei produzieren sie auch noch die Hälfte des Luftsauerstoffs unserer Atmosphäre.

Wie Enzyme Polysaccharide abbauen

Im Ozean und im menschlichen Verdauungstrakt gibt es eine wichtige Gemeinsamkeit. In beiden Systemen extrahieren Mikroben die in Pflanzen durch Photosynthese gespeicherten Kohlenstoffverbindungen und verwandeln sie in Energie und Nahrung. Der Aufbau dieser Verbindungen startet in den oberen lichtdurchfluteten Schichten, wo Mikroalgen große Mengen von Kohlenstoffdioxid mit Hilfe von Licht und Wasser in Zucker umwandeln und auf diese Weise Nahrung für heterotrophe Organismen herstellen. Sie polymerisieren die biologisch synthetisierten Einfachzucker in Polysaccharide, wie beispielsweise das Laminarin im Meer, und das funktionell entsprechende Polysaccharid Stärke an Land.

Das im Meer produzierte Pflanzenmaterial sinkt allmählich in die Tiefe. Auf dem Weg dorthin zerlegen mikrobielle Enzyme dieses Material, schließen es auf, wandeln es um und stellen es den größeren Organismen als Nahrung zur Verfügung. Beide Prozesse, im Meer und im menschlichen Darm, sind quantitativ signifikant. Es wird angenommen, dass Bakterien dank spezieller Enzyme sowie andere Organismen über 90% der im Meer gebildeten Algenmasse verdauen. Im Darm liefern Mikroben durch ihren enzymgetriebenen Umsatz von pflanzlichen Polysacchariden über 10% des menschlichen Kalorienbedarfs. Effiziente marine Verdauung beziehungsweise das menschliche Leben sind somit abhängig von der enzymatischen Umwandlung der pflanzlichen Polysaccharide durch Bakterien und dementsprechend wurde die Forschung auf diesem Gebiet in den letzten Jahren intensiviert [1].

Wenn man Oberflächenwasser entsalzt und die darin enthaltenden organischen Substanzen extrahiert und konzentriert, dann schmeckt das Meer süß. Die sich daraus ableitende Konzentration von Zuckersubstanzen deutet daher auf deren wichtige Rolle im Kohlenstoffkreislauf hin. Mit zunehmender Tiefe schwindet die Konzentration an Zuckern, was auf einen effizienten Verdau durch marine Organismen hindeutet. Es bleibt also eine zentrale Frage: Wie schaffen es marine Bakterien, die großen Mengen der in ihrer Struktur und Größe sehr diversen Polysaccharide zu verdauen, die von Algen gebildet werden? Die Verdauung dieser Substrate stellt eine Herausforderung dar, denn Polysaccharide können linear, chemisch modifiziert oder verzweigt sein (Abb. 1). Kohlenhydrate können darüber hinaus und anders als Proteine oder Nukleinsäuren, eine Vielzahl von Verknüpfungen und chemischen Modifizierungen aufweisen; somit ergibt sich für ein Hexaoligosaccharid theoretisch eine chemische Diversität von 1012 Molekülen [2]. Diese chemische und strukturelle Diversität kompliziert ihren Abbau, weil Bakterien sich an diese Formenvielfalt mit speziellen Enzymen anpassen müssen, um die Polysaccharide in Einfachzucker zu spalten. Diese Enzyme und Abbauwege sind vielfach immer noch unbekannt. Deren enorme Effizienz beim Abbau von Kohlenhydraten ergibt sich indirekt, denn es ist bekannt, dass über 99% der organischen Materie in der Wassersäule metabolisiert werden.

Abb. 1: Strukturelle und chemische Diversität von natürlichen Kohlenhydraten. (A) Agarose Oligosaccharid aus Rotalgen. (B) Porphyran Oligosaccharid aus Rotalgen (PDBid: 4AW7). (C) Verzweigtes Kohlenhydrat (PDBid: 4XX6). Diese Zuckerstrukturen wurden dank Co-Kristallisation mit Enzymen ermittelt. Kohlenstoff, grau; Schwefel, gelb; Stickstoff, blau; Sauerstoff, rot.

Bisher gibt es keine Anzeichen für eine langzeitliche Anreicherung von Kohlenhydraten in marinen Systemen. Das System scheint sich also in einem Fließgleichgewicht zu befinden, in dem Auf- und Abbau ausbalanciert sind. Wie Bakterien sich auf molekularer Ebene den jeweiligen Abbauprozessen anpassen können, studieren die Forscher mithilfe von Protein-Röntgenstrukturanalysen, die es erlauben, den Aufbau und die Funktion der Enzyme mit atomarer Auflösung zu bestimmen. Dazu kristallisieren die Forscher Enzyme zusammen mit ihren jeweiligen Zuckersubstraten, um deren Interaktion mit größtmöglicher Präzision abzubilden [3]. Zusammen mit biochemischen Experimenten zeigen diese Arbeiten, dass die Enzyme mariner Bakterien hochspezifisch sind und wie beim Schlüssel-Schloss-Prinzip mit ihren Zuckersubstraten interagieren. Da einzelne Bakterien nicht die gesamte Bandbreite an Enzymen besitzen können, erlaubt diese Spezialisierung, im Wettkampf um Nahrungssubstrate unterschiedliche Wege zu gehen [1].

Transfer von mikrobiellem Know-How und die Evolution der Mikroorganismen durch horizontalen Gentransfer

Wie Pflanzen enthalten auch Algen verschiedene Arten an Polysacchariden, auf die sich Bakterien mit unterschiedlichen Enzymen in einer bestimmten Reaktionsfolge spezialisieren können. Die Gene dieser Enzyme sind häufig auf den bakteriellen Genomen innerhalb genetischer Inseln lokalisiert; zusammen sind sie in den Abbau eines bestimmten Polysaccharids involviert. Zum Beispiel besitzen einige der menschlichen Darmbakterien spezielle Enzyme, um Polysaccharide aus Karotten und anderen Pflanzen zu verdauen, beispielsweise Xyloglukane, wohingegen andere sich auf die aus Hefen stammenden Alpha-Mannane spezialisieren [4]. Diese Art der Spezialisierung von Bakterien auf verschiedene Polysaccharide gibt es auch im Meer, zum Beispiel zur Metabolisierung von Polysacchariden aus Rot-, Braun- oder Grünalgen, und die Anpassung an bestimmte Kohlenhydrate ist hochdynamisch.

Die bisherigen Arbeiten der Forschungsgruppe zeigen, wie sich Bakterien erfolgreich an neue Kohlenhydrate durch horizontalen Gentransfer anpassen können. Der horizontale Gentransfer, der es Bakterien erlaubt, neue genetische Information in Form von genetischen Inseln aufzunehmen und in ihren Chromosomen zu integrieren, verleiht ihnen neue Fähigkeiten: Die gleichermaßen auf natürlichem Wege sich gentechnisch verändernden Mikroorganismen können so, weitere Arten von Kohlenhydraten erschließen und abbauen. Die Forschergruppe konnte nachweisen, dass planktonische Bakterien sogar mit großer Effizienz neue Gene aufnehmen und sie mit nahe verwandten Bakterien austauschen können, um so effizienter das aus Braunalgen stammende Polysaccharid Alginat zu verdauen [5]. Gentransfer und nicht eine bisher als zentraler Mechanismus vermutete Genduplikation war der zentrale Mechanismus, durch den Bakterien Ihre Abbauwege optimieren können (Abb. 2).

Abb. 2: Evolution von Bakterien durch Horizontalen Gentransfer.Die Zeitachse verläuft von unten nach oben. Die Mikroorganismen tauschen Gene untereinander aus (horizontale Pfeile), was zu einer erhöhten mikrobiellen Diversität und neuen biochemischen Fähigkeiten führt.

Die Forscher konnten außerdem zeigen, dass interessanterweise humane Darmbakterien japanischer Probanden eine Vielzahl von Genen aus marinen Bakterien aufgenommen und in ihr eigenes Genom integriert haben [6]. Diese Gene kodieren unter anderem Porphyranasen, die spezifisch das sulfatierte Polysaccharid Porphyran aus der Rotalge Nori verdauen. Als Folge können die Darmbakterien der Japaner diese Polysaccharide besser verdauen, die sie in Form von Nori, der Sushi-Alge, konsumieren [7]. Wie solche natürlichen Gentransfers die Effizienz der Verdauung im Meer und der Verdauung im humanen Darm verbessern, ist bisher noch nicht genau bekannt. Ein wichtiger Bestandteil der Forschung am Institut ist daher ein Teilprojekt über die Evolution und Anpassung von horizontal transferierten Enzymen beziehungsweise deren Genen, die aus dem Meer stammen, an ihre neue Umwelt im menschlichen Darm, wo sie einer höheren Temperatur und einer Sauerstoff freien Umgebung ausgesetzt sind. Somit könnten derart transferierte Gene auch als Modellsystem für die molekulare Anpassung an eine wärmer werdende Welt dienen.

Passgenaues Sezieren mariner organischer Materie mit Enzymen aus marinen Bakterien

Ein Problem der chemischen Analytik von organischen Molekülen im Seewasser ist, dass partikuläres und gelöstes organisches Material eben jene hohe Diversität von hochmolekularen, polymeren Substanzen enthält, die sich mit bisherigen Technologien nur schwer auftrennen und somit beschreiben lassen. Wir wissen vielfach nicht, woraus genau die hochmolekulare organische Materie im Meer zusammengesetzt ist, welche Moleküle von marinen Organsimen beispielsweise schnell verdaut werden können und somit wichtige, schnelle Energielieferanten darstellen oder aber welche Moleküle nur langsam abgebaut werden und somit Langzeitspeicher von organischem Kohlenstoff im Meer bilden. Diese Unkenntnis beschränkt unsere Möglichkeiten, das Verhalten mariner Systeme vorherzusagen, wenn sich im Zuge der Klimaerwärmung die Zusammensetzung der Mikroalgen Spezies und der von ihnen produzierten hochmolekularen Substanzen verändert. Bakterien meistern dieses Problem, denn die Evolution erlaubt es ihnen, Werkzeuge in Form von adaptierten Enzymen und Rezeptoren zu entwickeln, mit denen sie diejenigen Moleküle erkennen, die ihrer Ernährung dienen.

Die für die Analytik ausgesuchten Enzyme werden rekombinant in speziellen Bakterien hergestellt. Mit diesen Enzymen kann man im nächsten Schritt die unbekannten Moleküle aus Umweltproben passgenau zerschneiden und nachfolgend die Fragmente quantifizieren. Man macht sich dabei das Schlüssel-Schloss-Prinzip zunutze (Abb. 3), das die hohe Spezifität der Enzyme begründet und die gezielte Hydrolyse von Zuckerstrukturen in mariner, organischer Materie erlaubt. Das Prinzip dieser Analyse ist ähnlich dem der Restriktionsenzyme, mit denen eine zu charakterisierende DNA nur an genau definierten, bekannten Sequenzmotiven zerschnitten wird und auf diese Weise definierte Fragmente erzeugt. Die Ergebnisse zeigen eindeutig: Die Spaltprodukte der organischen Substrate sind für jede Alge charakteristisch wie ein Barcode im Supermarkt.

Abb. 3: Bakterielle Enzyme als Werkzeuge für die Untersuchung des Kohlenstoffkreislaufs. (A) Das Bild aus der Röntgenstrukturanalyse zeigt das Enzym (blau) mit seinem passgenauen Zuckersubstrat (gelb). (B) Der analytische Ansatz, modellhaft gezeigt am Beispiel der Rotalgen. Die drei Enzyme A, B und C von unterschiedlicher Spezifität zerteilen Polysaccharide aus Rotalgen in unterschiedliche Spaltprodukte, die nachfolgend identifiziert und quantifiziert werden können. (C) Organische Materie aus dem Meer wird vor der Analyse auf Filtern angereichert. (D) Nach Enzymverdau werden die Spaltprodukte quantifiziert.

Der Vorteil dieser Analytik liegt auf der Hand: Die Messung der Spaltprodukte ist erheblich einfacher als die der unverdauten Polysacharide - sie sind besser löslich und chromatographischen Methoden besser zugänglich - und die Menge und der Umsatz an definierten Polysacchariden im Meerwasser ist quantifizierbar. Die ersten Ergebnisse dank dieser in der Meereschemie neuen Methode bestätigen, dass bestimmte Kohlenhydrate eine der wichtigsten Energiequellen im marinen Kohlenstoffkreislauf darstellen.

Ausblick

Neben den hier beschriebenen neuen Techniken hat sich auch die Methode der DNA-Sequenzierung und –Analyse in den letzten Jahren rasant weiter entwickelt. Am Institut wird die Sequenzierung der mikrobiellen Gemeinschaften vorangetrieben, um die Ökologie und die biochemischen Mechanismen des Kohlenstoffkreislaufs besser zu verstehen. Dank dieser Möglichkeiten lassen sich die Geheimnisse dieser sehr effizienten bakteriellen Verdauungsmaschinerien nach und nach lüften. Die Metagenome der Mikroorganismen weisen hier den Weg, denn sie können wie eine Anleitung gelesen werden, um die wichtigsten enzymatischen Werkzeuge für den Abbau der Algenbiomasse zu identifizieren und im Labor rekombinant nachzubauen. Als hochspezifische Werkzeuge helfen sie dann bei der Analytik des marinen Kohlenstoffkreislaufs.

Literaturhinweise

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Hehemann, J. H.; Kelly, A. G.; Pudlo, N. A.; Martens, E. C.; Boraston, A. B.
Bacteria of the human gut microbiome catabolize red seaweed glycans with carbohydrate-active enzyme updates from extrinsic microbes
Proceedings of the National Academy of Sciences USA 109, 19786-19791 (2012)
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