Forschungsbericht 2017 - Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie

Synthetische Kohlenstoffdioxid-Fixierung

Autoren
Erb, Tobias
Abteilungen
Max-Planck-Forschungsgruppe Biochemistry and Synthetic Biology of Microbial Metabolism
Zusammenfassung
Die Umwandlung des Treibhausgases Kohlenstoffdioxid (CO2) in organische Verbindungen ist ein Schlüsselprozess im globalen Kohlenstoffkreislauf. In den letzten Jahren wurden mehrere neue Stoffwechselwege und Enzyme zur CO2-Bindung in Mikroorganismen entdeckt. Parallel zu diesen Entdeckungen wurden Ansätze vorangetrieben, mit Hilfe synthetischer Biologie künstliche Stoffwechselwege zur Kohlenstoff-Fixierung zu realisieren, die effizienter als die natürlich existierenden Stoffwechselwege sind. Die synthetische CO2-Fixierung könnte neue Anwendungen in Bio- und Nanotechnologie ermöglichen.

Chemie und Biologie der Kohlenstoff-Fixierung

Die wichtigste Reaktion im globalen Kohlenstoffkreislauf ist die Umwandlung von atmosphärischem Kohlenstoffdioxid (CO2) in organische Materie. Dieser Prozess, der auch als Kohlenstoff-Fixierung bezeichnet wird, ernährt sprichwörtlich alles Leben auf der Erde: Die fotosynthetische Kohlenstoff-Fixierung von Pflanzen steht am Anfang unserer Nahrungskette. Darüber hinaus bildet fixierter Kohlenstoff in Form fossiler Rohstoffe die Grundlage unserer modernen Industrie- und Energieproduktion. Da aber fossile Rohstoffe endlich sind und die Konzentrationen des Treibhausgases CO2 stetig steigen, wird vermehrt nach neuen Möglichkeiten gesucht, eine nachhaltige Kohlenstoffökonomie der Zukunft zu verwirklichen.

Trotz intensiver Forschung gelang es der Chemie bisher nicht, Katalysatoren zu entwickeln, die es erlauben, im Großmaßstab atmosphärisches CO2 unter milden Prozessbedingungen in Mehrfachkohlenstoffverbindungen zu überführen. Im Gegensatz dazu bietet die Biologie mehrere Lösungen. Die bekannteste ist die bereits erwähnte fotosynthetische Kohlenstoff-Fixierung in Pflanzen, der Calvin-Zyklus, durch den netto fast 70 Gigatonnen Kohlenstoff pro Jahr fixiert werden. Neben Pflanzen nutzen auch Algen und viele Bakterien den Calvin-Zyklus. Insgesamt werden geschätzt rund 90 Prozent im globalen Kohlenstoffkreislauf über diesen Stoffwechselweg gebunden. In den letzten Jahren wurden fünf weitere, alternative Stoffwechselwege zur Kohlenstoff-Fixierung in Mikroorganismen entdeckt, die ebenfalls eine wichtige Rolle im globalen Kohlenstoffkreislauf spielen und Gegenstand aktueller Untersuchungen sind [1, 2].

Obwohl diese natürlich entstandenen Stoffwechselwege im Gigatonnen-Maßstab CO2 fixieren, sind sie in vielerlei Hinsicht nicht perfekt. Das Produkt biologischer Kohlenstoff-Fixierung ist Biomasse, ein komplexes Gemisch, das sich nicht als Rohstoff für die chemische Industrie eignet. Hinzu kommt, dass viele natürliche Stoffwechselwege in ihrer Kohlenstoff-Fixierung limitiert sind. Ein Beispiel ist der Calvin-Zyklus selbst mit seinem CO2-bindenden Enzym RubisCO. Die RubisCO setzt nur fünf bis zehn Moleküle CO2 pro Sekunde um. Gleichzeitig zeigt das Enzym eine unerwünschte Nebenreaktion mit Sauerstoff. Eine durchschnittliche RubisCO besitzt eine Fehlerrate von etwa 20 Prozent mit Sauerstoff, was die Effizienz der Fotosynthese stark einschränkt.

Neue CO2-bindende Enzyme eröffnen neue Möglichkeiten

Gibt es Alternativen zur RubisCO-abhängigen Kohlenstoff-Fixierung? Vor einiger Zeit wurde in Alphaproteobakterien eine neue Familie CO2-bindender Enzymen entdeckt, die reduktiven Enoyl-CoA Ester Carboxylasen (ECRs, Abb. 1). Diese Enzyme sind interessant, weil sie bis zu 120 CO2 Moleküle pro Sekunde umsetzen können und damit zwanzigmal schneller CO2 fixieren können als die RubisCO und weil sie keine Seitenreaktion mit Sauerstoff zeigen [3]. Um zu verstehen, was ECRs zu so effizienten CO2-bindenden Enzymen macht, wurde mithilfe speziell entwickelter spektroskopischer Methoden der Katalyse-Zyklus dieser Enzyme untersucht. Dadurch konnten einzelne chemische Vorgänge während der Katalyse zeitaufgelöst dargestellt werden, vergleichbar mit einer Art Enzym-Zeitlupe [4]. Diese detaillierten Einblicke in die Biochemie der ECRs legten die Grundlage, diese Enzyme gezielt zur CO2-Bindung zu modifizieren. Unter Zuhilfenahme von Enzym-Kristallstrukturen [5] wurde das Substratspektrum von ECRs durch Mutagenese des aktiven Zentrums erweitertet. Damit steht eine Vielzahl neuer, effizienten CO2-Bindungsreaktionen für die Biokatalyse zur Verfügung [6].

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Abb. 1: Reduktive Enoyl-CoA Carboxylasen (ECRs) sind hocheffiziente und versatile Enzyme zur CO2-Fixierung. (A) Reduktive Carboxylierung von Enoyl-CoA Estern durch ECRs. (B) Vergleich der CO2-Fixierungsaktivität von ECRs mit anderen Carboxylasen. (C) Maßschneidern von ECR: Drei Mutationen im aktiven Zentrum erweitern das Substratspektrum des Enzyms für längerkettige und verzweigte Substrate.

Die synthetische Biologie zeigt neue Wege zur CO2-Fixierung

Wie können diese neuen Reaktionen zur Kohlenstoff-Fixierung eingesetzt werden? Eine Idee ist, mithilfe synthetischer Biologie künstliche Kohlenstoff-Fixierungswege zu entwerfen, die natürlich entstandenen Stoffwechselwegen überlegen sind [7,8]. Mehrere Labore haben sich diesem Ziel verschrieben. Bisher allerdings konnte kein künstlicher Kohlenstoff-Fixierungsweg realisiert werden. Viele Ansätze scheiterten an dem Versuch, solche künstlichen Stoffwechselwege direkt in lebenden Organismen zusammenzusetzen. Es fehlt das grundlegende biologische Verständnis, wie sich die einzelnen Enzyme im Zusammenspiel verhalten und wie sich der jeweilige künstliche Stoffwechselweg in den komplexen Metabolismus des Wirtes einfügt.

Aus diesem Grund gewinnen in letzter Zeit bottom-up Ansätze an Popularität, die eine reduktionistische Strategie verfolgen [8, 9]. In diesen Ansätzen werden künstliche Stoffwechselwege von Grunde auf aus einzelnen Enzymen schrittweise – eben bottom up – zusammengesetzt (Abb. 2). Dazu werden in einer ersten, theoretischen Phase mit Hilfe metabolischer Retrosynthese plausible biochemische Reaktionen zu möglichen Stoffwechselwegen kombiniert. Danach werden das thermodynamische Profil und der voraussichtliche Energie-Verbrauch dieser theoretischen Stoffwechselwege abgeschätzt, um bewerten zu können, welcher der Designer-Wege sich zur experimentellen Umsetzung eignet. Anhand dieser Vorgehensweise wurden kürzlich verschiedene synthetische Kohlenstoff-Fixierungswege entworfen, die alle auf einer effizienten ECR-Reaktion basieren. Berechnungen zeigen, dass diese theoretischen Zyklen durchschnittlich 20 Prozent weniger Energie pro gebundenem CO2 benötigen als der auf RubisCO-basierte Calvin-Zyklus, was das grundsätzliche Potential synthetischer Kohlenstoff-Fixierung unterstreicht [8].

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Abb. 2: Strategie zur Realisierung synthetischer CO2-Fixierung. Die Entdeckung der effizienten ECR-Carboxylasen bildet den Ausgangspunkt zum Entwurf verschiedener CO2-Fixierungszyklen mittels metabolischer Retrosynthese. Die theoretisch möglichen Zyklen werden hinsichtlich thermodynamischer Eigenschaften bewertet und Enzymkandidaten zu ihrer Umsetzung in bioinformatischen Datenbanken identifiziert. In einer experimentellen Phase werden die Enzymkandidaten exprimiert und charakterisiert. Aus geeigneten Kandidaten wird der synthetische Stoffwechselweg im Reagenzglas rekonstituiert und in mehreren Runden optimiert, wobei Enzym-Engineering und metabolisches Korrekturlesen angewendet werden.

Vom Design zur Realisierung synthetischer CO2-Fixierung

Im Anschluss an die Design-Phase folgt die experimentelle Umsetzung der theoretischen Stoffwechselwege. Es gilt entsprechende Enzyme zu finden, die die einzelnen Reaktionen des jeweiligen Stoffwechselweges katalysieren. Eine wichtige Quelle zum Erfolg bilden Datenbanken, in denen bisher mehr als 40.000 verschiedene Enzymreaktionen abgelegt wurden. Dennoch kommt es vor, dass für einzelne Reaktionen bisher kein entsprechendes Enzym beschrieben wurde. Mittels Durchmustern von (meta-) genomischen Bibliotheken oder durch gezieltes Protein-Engineering können diese fehlenden Enzyme gefunden beziehungsweise maßgeschneidert werden.

Ein anderes Problem bei der Realisierung synthetischer Stoffwechselwege ist die Neukombination von Enzyme aus völlig unterschiedlichen Organismen in einen gemeinsamen Stoffwechselweg. Dadurch geraten viele Enzyme mit Stoffwechselprodukten in Berührung, denen sie im Laufe der Evolution nie ausgesetzt waren. Es zeigen sich oft unerwünschte Seitenreaktionen und Inhibitionen, die es zu verhindern gilt. Um solche Seitenreaktionen zu minimieren, können einzelne Enzyme wiederum auch maßgeschneidert werden. Eine Alternative dazu ist das metabolic proofreading, das Hinzufügen zusätzlicher, korrigierender Enzyme, die die unerwünschten Seitenprodukte entfernen und wiederverwerten. Obwohl das Prinzip des Korrekturlesens aus natürlichen Stoffwechselwegen bekannt ist [10], wurde es bisher nicht systematisch im metabolischem Engineering beziehungsweise der synthetischen Biologie eingesetzt. Erste Erfahrung im Umsetzen der synthetischen CO2-Fixierung zeigen jedoch, dass das metabolische Korrekturlesen die Effizienz von Designer-Stoffwechselwegen um bis zu einen Faktor zehn steigern kann [8].

Der CETCH-Zyklus: Vom Reagenzglas in lebende Organismen

Am Ende des Gesamtprozesses steht ein funktionsfähiger Stoffwechselweg in vitro, das heißt, im Reagenzglas. Für einen künstlichen Kohlenstoff-Fixierungsweg, den CETCH-Zyklus, konnte dieses Ziel kürzlich erreicht werden (Abb. 3A). Der CETCH-Zyklus setzt sich aus insgesamt siebzehn Enzymen zusammen, die aus neun verschiedenen Organismen stammen, darunter befinden sich auch drei maßgeschneiderte Enzyme. Im Reagenzglas fixiert der CETCH-Zyklus CO2 mit einer Rate von 5 nmol CO2 pro Minute und mg Protein [8]. Diese Raten im Reagenzglas sind in etwa vergleichbar mit Messungen des Calvin-Zyklus in Zellextrakten.

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Abb. 3: Der CETCH-Zyklus, ein synthetischer Stoffwechselweg zur kontinuierlichen Fixierung von CO2, der mit Hilfe der Strategie wie in in Abb. 2 dargestellt realisiert wurde [8]. (A) Topologie des CETCH-Zyklus. (B) Mögliche zukünftige Anwendungen des CETCH-Zyklus: Durch die Transplantation in verschiedene Organismen könnten künstliche CO2-Fixierungswege, wie der CETCH-Zyklus, effizienter als natürliche Stoffwechselwege CO2 in Biomasse oder gezielte Produkte umwandeln. Alternativ dazu könnten künstliche CO2-Fixierungswege die Basis für die Entwicklung artifizieller, biomimetischer Chloroplasten bilden, die von Strom, Wasserstoff oder Elektrizität angetrieben werden.

In vitro-Stoffwechselwege zur Kohlenstoff-Fixierung wie der CETCH-Zyklus bilden den Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen (Abb. 3B). Zuallererst sind solche in vitro-Stoffwechselwege minimale Systeme, die es erlauben, die generelle Arbeitsweise, Plastizität und Robustheit komplexer metabolischer Netzwerke zu studieren. Zum anderen sind sie ein wichtiger Schritt in Richtung des großen Ziels synthetische CO2-Fixierung auch in vivo, das heißt im lebenden Organismus, zu erreichen. Durch Transplantation in geeignete Wirtsorganismen könnten sie eines Tages eventuell die fotosynthetische Effizienz erhöhen oder zur gezielten Produktion von chemischen Bausteinen aus refixiertem CO2 eingesetzt werden. Schließlich bieten synthetische Stoffwechselwege auch die Möglichkeit, neue Technologien an der Schnittstelle zwischen Nano- und Biotechnologie zu entwickeln, wie zum Beispiel biomimetische Organelle zur künstlichen Fotosynthese („künstliche Chloroplasten“).

Zusammenfassung

Die synthetische CO2-Fixierung ist ein Forschungsfeld an der Schnittstelle von Biologie und Chemie, das radikal neue Lösungen aufzeigen kann, die effizienter sein können als natürlich entstandene Stoffwechselwege. Die Konstruktion synthetischer Stoffwechselwege im bottom-up Ansatz ist eine Weiterentwicklung der Biologie von einer deskriptiv-analytischen zu einer synthetisch-konstruktiven Wissenschaft, die grundlegende Designprinzipien metabolischer Netzwerke offenlegt und neue (bio-) technologische Möglichkeiten eröffnen kann.

Danksagung

Die hier vorgestellten Arbeiten entstanden in Zusammenarbeit mit Marc-Olivier Ebert (ETH Zürich), Ivan Berg (Westfälische Wilhelms-Universität Münster) und Julia Vorholt (ETH Zürich). Dieser Bericht basiert in einigen Teilen auf einem Beitrag in BIOspektrum (DOI: 10.1007/s12268-016-0733-9), der mit Erlaubnis der Springer-Verlags GmbH (Heidelberg) verwendet wurde.

Literaturhinweise

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Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway
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