Forschungsbericht 2017 - Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie

Die Jungbrunnen des Immunsystems

Autoren
Melchers, Fritz
Abteilungen
Senior Research Group Lymphocyte Development
Zusammenfassung
Ein Leben lang sind hämatopoietische Stammzellen die Quellen der Zellen des Immunsystems. Wir haben ihre embryonalen Ursprünge, ihre Wanderung aus Blut in fötale Leber, ihre Residenz im Knochenmark und ihre Fähigkeiten dahingehend untersucht, reife Zellen des Immunsystems zu bilden. Überraschenderweise bieten sie ruhenden latenten Formen von Tuberkulose (TB)-Bakterien eine langzeitige Bleibe. So stellen sie eine ständige Gefahr für den Ausbruch von aktiver TB, aber auch die Quelle eines dauernd produzierten TB-Impfstoffs dar.

Stammzellen-Reparatur mittels CRISPR-Cas9

Biologen sind von der lebenslangen Fähigkeit der hämatopoietischen Stammzellen und ihrer Flexibilität fasziniert, die es ihnen erlaubt, ein Leben lang als einzelne Zellen entweder in völliger Ruhe in speziellen, Energie-sparenden Nischen des Knochenmarks zu verharren, oder aktiv zu werden, im Blut durch den ganzen Körper zu wandern, und wieder ins Knochenmark zurückzufinden. Bei der Maus, und sicher auch beim Menschen, reicht eine einzige Zelle, um nach Transplantation in einen lethal bestrahlten, chemotherapeutisch behandelten Rezipienten alle tausend Milliarden roter und weißer Blutzellen einer Maus, und tausend mal mehr Zellen des Menschen zu regenerieren.

Das wiederum begeistert die Kliniker, die hoffen, ein defektes Gen, das zu Immundefizienz führt, mit Hilfe von Gentherapie in hämatopoietischen Stammzellen reparieren zu können. Dabei sind sie darauf angewiesen, dass diese Stammzellen nach der Reparatur immer noch alle Eigenschaften haben, mit denen sie ihre Nischen im Knochenmark langzeitig wieder füllen, mit denen sie aktiv werden, wandern können und alle Typen von Blutzellen bilden - in unveränderter Zahl und Qualität. Sie sind fasziniert von der traumwandlerischen Sicherheit der Stammzellen, nach intravenöser Transplantation ihren Weg durch die Wände der Blutbahnen in die Nischen des Knochenmarks zu finden, in denen sie wieder ein Leben lang die Blutzellproduktion übernehmen.

Am saubersten wäre es, diese Transplantationen mit einer einzigen Stammzelle, ohne mögliche Verunreinigung durch andere, möglicherweise immun-auto-aggressive, oder nicht präzise Gen-reparierter Zellen durchführen zu können. Die neue CRISPR-Cas9 Gen-Reparaturmethode verspricht, den Ersatz eines defekten Gens durch ein normal funktionierendes ohne die bisher so gravierenden Fehler zu bewerkstelligen, die der virale Einbau solcher Gene durch unerwünschte, krebserregende Insertions-Mutagenese bisher zu gefährlich gemacht hat, hämatopoietischen Defizienzen in hämatopoietischen Stammzellen zu heilen. Aber selbst wenn der Einbau des reparierenden Gens präzise ist, bleibt noch viel zu tun, die hämatopoietischen Stammzellen rezeptiv für den Gen-Einbau zu machen. Da der Einbau in Gewebekultur außerhalb der normalen Nischenumgebung im Knochenmark gemacht werden muss, sind – auch unsere – noch nicht befriedigenden Anstrengungen wichtig, die Stammzellen „bei Laune“ zu halten, sodass sie ihre vielen Fähigkeiten nicht verlieren, nach Genkorrektur und Transplantation im Rezipienten ein stabiles, langzeitig funktionierendes Blut- und Immunsystem zu restorieren.

Auch Onkologen, die Krebspatienten mit Bestrahlung und Chemotherapie von Krebszellen befreien wollen, danach aber all die ebenfalls zerstörten normalen Zellen des Bluts und des Immunsystem eines Patienten mit einer „Knochenmarks-Transplantation“ retten müssen, würden wohl am liebsten nur eine einzige, gesunde Stammzelle, frei von verunreinigenden Krebszellen transplantieren.

Wir hatten es uns also zum Ziel gesetzt, zu verstehen, wie eine Stammzell-Nische im Knochenmark gebildet wird, wie sie funktioniert, und ob wir sie in Gewebekultur nachbauen können.

Können wir hämatopoietische Stammzellen in Gewebekultur aus toti-potenten embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) oder aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) entwickeln?

Vor der neuerlichen Entdeckung und Entwicklung der CRISPR-Cas9 homologen Geninsertionsmethode waren ES-Zellen die einzigen, in denen der Einbau eines Gens in das Erbgut der Zelle an der richtigen Stelle, also mittels homologer Rekombination möglich war. Wenn es uns also gelungen wäre, aus ES-Zellen hämatopoietische Stammzellen zu entwickeln, wären wir in der Lage gewesen, die Funktion und mögliche Reparatur von wichtigen Genen zu untersuchen. Unsere mehrjährigen Versuche [1] sind aber, wie auch die mehrerer anderer Arbeitsgruppen, erfolglos geblieben.

Weil diese Gewebekulturen wohl reife Zellen des Blut-und Immunsystems entwickelten, sie aber zu keiner Zeit dieser Entwicklung transplantierbare Stammzellen bildeten, hatten wir den Verdacht, dass sie vielleicht in einer Endothel- und Nischen-losen Gewebekulturumgebung nicht gelernt hätten, normal zu wandern und zu residieren.

Wie also bewerkstelligen es hämatopoietische Stammzellen und Progenitoren, vom Blut durch die Blutwand auf die Innenseite von fötaler Leber und in das Knochenmark zu gelangen?

Stammzellen bilden auf ihrer Oberfläche eine Vielzahl verschiedener Rezeptoren für Chemokine aus, die sie in die Lage versetzen, auf Erkennung eines solchen Chemokins hin chemotaktisch angezogen zu wandern. Welche Rezeptoren sie dabei benutzen, welche Chemokine das vaskuläre Endothel der Blutwand und das mesenchymale Stroma bereitstellen, damit sie mit ihren Zytokin-Rezeptoren die vom Mesenchym bereitgestellten Zytokine, zum Beispiel IL7, erkennen und zu lymphoider Differenzierung stimuliert werden, ist in [2] im Detail beschrieben und in Abbildung 1 dargestellt.

Sind die hämatopoietischen Stammzellen und die sich daraus differenzierenden Vorläufer-B-Lymphozyten am Mesenchym der fötalen Leber angelangt, dann beginnen sie, Immunglobulin (Ig) Gene zu rearrangieren und danach IgM-Antikörper auf ihrer Oberfläche zu deponieren – je Zelle immer einen einzigartigen Antigenrezeptor. Es ist gelungen, durch Transformation mit Onkogenen die verschiedenen Stufen dieser Zellentwicklung nachzustellen und in einzelnen Stufen zu fixieren [3]. Damit wurden jetzt Instrumente geschaffen, die erlauben, die Repertoireentwicklung dieser ersten B1-Welle der Antikörper-produzierenden B-Zellen unseres Immunsystems zu vermessen und ihre maligne Transformation zu B-Zell Lymphome zu verfolgen.

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Original 1508158449
Abb. 1: Chromotaxis-kontrollierte Wanderung hämatopoietischer Stammzellen aus dem Blut durch die Wände der Blutgefäße in die fötale Leber. Die Wanderung wird geleitet von löslichen, sezernierten Chemokingradienten, in Stufe 1 CCL19, produziert von Blutgefäß-Endothelium und erkannt vom CCR7-Rezeptor auf HSC/MPP, in Stufe 3 CXCL12, produziert von mesenchymalem Stroma und erkannt vom CXCR4-Rezeptor auf HSC/MPP – oder geleitet von unlöslichen, GAG-adhäsiven Chemokingradienten, in Stufe 2 CXCL10/11, produziert von Blutgefäß-Endothelium und erkannt vom CXCR3-Rezeptor auf HSC/MPP, in Stufe 4 CXCL12, produziert von mesenchymalem Stroma und erkannt vom CXCR4-Rezeptor auf HSC/MPP. Das Zytokin IL7, produziert von mesenchymalem Stroma, wird durch den IL7-Rezeptor (IL7R) auf den HSC/MPP erkannt und induziert sie zu B1-Lymphozyten-Differenzierung in der fötalen Leber.
Abb. 1: Chromotaxis-kontrollierte Wanderung hämatopoietischer Stammzellen aus dem Blut durch die Wände der Blutgefäße in die fötale Leber. Die Wanderung wird geleitet von löslichen, sezernierten Chemokingradienten, in Stufe 1 CCL19, produziert von Blutgefäß-Endothelium und erkannt vom CCR7-Rezeptor auf HSC/MPP, in Stufe 3 CXCL12, produziert von mesenchymalem Stroma und erkannt vom CXCR4-Rezeptor auf HSC/MPP – oder geleitet von unlöslichen, GAG-adhäsiven Chemokingradienten, in Stufe 2 CXCL10/11, produziert von Blutgefäß-Endothelium und erkannt vom CXCR3-Rezeptor auf HSC/MPP, in Stufe 4 CXCL12, produziert von mesenchymalem Stroma und erkannt vom CXCR4-Rezeptor auf HSC/MPP. Das Zytokin IL7, produziert von mesenchymalem Stroma, wird durch den IL7-Rezeptor (IL7R) auf den HSC/MPP erkannt und induziert sie zu B1-Lymphozyten-Differenzierung in der fötalen Leber.

Sind die Stammzellen und Vorläuferzellen einmal in ihren Nischen im Knochenmark angekommen, wie schaffen sie es dann, sesshaft zu werden?

Die Aktivitäten einer Micro-RNA hat uns geholfen, zu entdecken, dass Adhäsion an Zellen in den Nischen eine Residenz ermöglicht. Alle hämatopoietischen Zellen des Knochenmarks, die nach Transplantation in das Knochenmark zurückwandern und dort wieder sesshaft werden können, bilden miR221. Experimentell induzierte Re-expression dieser miR221 in PräB-Zellen, die nach Transplantation normalerweise im Knochenmark nicht mehr sesshaft werden können, bewirkt, dass diese Zellen die Fähigkeit wiedergewinnen, ihre Residenz in subostealen Nischen zu beziehen. In Gewebekultur erlangen diese Zellen die Fähigkeit, an einem Adhäsionsmolekül, VCAM, zu haften. Sie können das, weil miR221 gezielt die Messenger RNA von PTEN abbaut. PTEN inhibiert einen Signaltransduktionsweg der Zelle, bei dem Pi3-Kinase, Akt, Paxilin, Talin und fokale Adhäsionskinase (FAK) das Adhäsionsmolekül Integrin VLA4 aktiviert. Wenn PTEN abnimmt, wird Pi3Kinase Aktivität erhöht und damit auch die komplette Signaltransduktionskette stärker aktiviert, sodass am Ende der Kette die Integrinmoleküle ihre Konformation ändern mit der Folge, dass sie VCAM1 viel besser binden können (Abb. 2; [4]). Wir vermuten, dass alle hämatopoietischen Zellen mit der Fähigkeit, in Nischen des Knochenmarks sesshaft zu werden, diesen miR221-regulierten molekularen Mechanismus der Adhäsion durch Integrine für ihre Residenz benutzen.

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Original 1508158450
Abb. 2: Erhöhte Expression von miR221 in Vorläufer-B-Lymphozyten verstärkt deren Adhäsion an das Adhäsionsmolekül VCAM1 in Gewebekultur und erlaubt ihre Residenz in subostealen Nischen des Knochenmarks. (A) MiR221 Expression ändert die Expression seiner Zellzyklus-Zielgene p27kip1, Cyclin 1 und 2 und das kit-Ligand-abhängige Wachstum der Vorläufer-B-Zellen nicht, wohl aber ihre IL7-stimulierte Langlebigkeit durch erhöhte bcl2 Expression. In Abwesenheit von miR221 Expression stimuliert das von mesenchymalem Stroma produzierte Chemokin CXCL12 durch den CXCR4-Rezeptor eine basale Aktivität von Signaltransduktion via Pi3Kinase, Akt Paxilin, Talin und Fokaler Adhäsionskinase (FAK), die jedoch Integrin nicht aktiviert. (B) Induktion von miR221 Expression führt zu einem Abbau der Messenger RNA seines Target-Gens, PTEN, das normalerweise die Aktivität von Pi3Kinase inhibiert. Der Abbau von PTEN führt also zu erhöhter Pi3Kinase-Akt-Paxilin-Talin-FAK Signaltransduktion, die ihrerseits eine Aktivierung von Integrin VLA4 zur Folge hat: Die b-Kette des Integrins öffnet ihre Konformation und ist danach in der Lage, ihren Liganden VCAM mir erhöhter Affinität zu binden. Das führt dazu, dass die Vorläufer-B-Zellen nun in den subostealen Nischen des Knochenmarks residieren können.
Abb. 2: Erhöhte Expression von miR221 in Vorläufer-B-Lymphozyten verstärkt deren Adhäsion an das Adhäsionsmolekül VCAM1 in Gewebekultur und erlaubt ihre Residenz in subostealen Nischen des Knochenmarks. (A) MiR221 Expression ändert die Expression seiner Zellzyklus-Zielgene p27kip1, Cyclin 1 und 2 und das kit-Ligand-abhängige Wachstum der Vorläufer-B-Zellen nicht, wohl aber ihre IL7-stimulierte Langlebigkeit durch erhöhte bcl2 Expression. In Abwesenheit von miR221 Expression stimuliert das von mesenchymalem Stroma produzierte Chemokin CXCL12 durch den CXCR4-Rezeptor eine basale Aktivität von Signaltransduktion via Pi3Kinase, Akt Paxilin, Talin und Fokaler Adhäsionskinase (FAK), die jedoch Integrin nicht aktiviert. (B) Induktion von miR221 Expression führt zu einem Abbau der Messenger RNA seines Target-Gens, PTEN, das normalerweise die Aktivität von Pi3Kinase inhibiert. Der Abbau von PTEN führt also zu erhöhter Pi3Kinase-Akt-Paxilin-Talin-FAK Signaltransduktion, die ihrerseits eine Aktivierung von Integrin VLA4 zur Folge hat: Die b-Kette des Integrins öffnet ihre Konformation und ist danach in der Lage, ihren Liganden VCAM mir erhöhter Affinität zu binden. Das führt dazu, dass die Vorläufer-B-Zellen nun in den subostealen Nischen des Knochenmarks residieren können.

Können ruhende hämatopoietische Stammzellen Ruhe für symbiotische Bakterien bieten?

Nischen der hämatopoietischen Stammzellen finden sich nahe vaskulärem Endothel der Blutgefäße, durch das sie vom Blut in das Innere des Knochenmarks gewandert sind. Ein Teil von ihnen teilt sich regelmäßig, vielleicht einmal am Tag und asymmetrisch. Eine der Tochterzellen bleibt eine Stammzelle, erneuert sich also in diesem Teilungsprozess, während sich die andere auf die Wege der Differenzierung macht, bei denen am Ende reife Zellen des Blut- und Immunsystems gebildet werden. Ein anderer Teil der Stammzellen verharrt in einem Zustand der metabolischen Ruhe, in dem sich die Zellen fast nie, nur vielleicht zweimal im Jahr teilen und Energie-sparende molekulare Programme nutzen, um lange zu überleben. So haben sie die oxidative Phosphorylierung in Mitochondrien reduziert, auch, weil sie viele dieser Mitochondrien durch Autophagie abgebaut haben. Sie produzieren das wenige ATP, das sie zum Überleben brauchen, durch Lipolyse und Glycolyse. Viele dieser Stammzellen haben Hypoxie Gene aktiviert, was darauf schließen lässt, dass sie in Gegenden des Knochenmarks residieren, die eine niedere Sauerstoffzufuhr haben. Diese ruhenden Zellen besitzen die beste Langzeit-Repopulationskraft bei Transplantationen. Unsere Analysen haben sie in einem Reservoir von nicht mehr als 10 000 Langzeit-ruhenden Zellen des Knochenmarks einer Maus gefunden.

Wäre es möglich, dass Bakterien, die innerhalb von hämatopoietischen Zellen existieren können, also „fakultativ intrazellulär“ sind, diese Inseln der Ruhe, also die Nischen der langlebigen Stammzellen, dazu nutzen, selbst langlebig und ruhend zu werden? Könnten diese Stammzellen zu Depots von latenten Infekten werden? Stammzellen könnten ja aus dem Knochenmark durch das Blut an Stellen einer Infektion wandern, infiziert werden, und danach in die Ruhe der Nischen des Knochenmarks zurückkehren.

Ein solches fakultativ intrazelluläres Bakterium ist Mycobacterium tuberculosis (M.tb), der Erreger der Tuberkulose. Es wird geschätzt, dass ein Drittel der Weltbevölkerung, also 2,5 Milliarden Menschen, latent mit M.tb. infiziert ist, ohne dass es zum Ausbruch von Tuberkulose kommt. „Nur“ 10 Millionen Menschen sterben jährlich an Tuberkulose - ein Zeichen effektiver Immunität? Das Immunsystem ist in diesen Menschen durch die Infektion zu einer Abwehr aktiviert worden, die durch M.tb.-spezifische Immunreaktionen nachweisbar ist (Abb. 3).

Trotz unseres Verdachts war es sehr überraschend, dass selektiv etwa 1 % der langlebigen hämatopoietischen Stammzellen, und nur sie, in latent M.tb. infizierten Mäusen und Menschen das Bakterium trugen [5]. Diese M.tb. Bakterien scheinen sich, wie ihre Gastzellen, in einem Ruhezustand zu befinden, in dem sie sich nicht teilen und in dem sie Gene benutzen, die bei Dormanz aktiviert sind. Diese dormanten Bakterien können also eine Quelle möglicher Wiederbelebung von akut infizierenden M.tb. sein, die so zu lebensgefährlicher Tuberkulose führen kann. Andererseits können die infizierten Stammzellen auch kontinuierliche Quellen der Produktion von M.tb. Antigenen, also einer M.tb. Vakzine sein, die die Immunität gegen die möglicherweise lebensbedrohende Infektion aufrechterhält.

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Original 1508158450
Abb. 3: Kompartimente der hematopoietischen Stammzellen im Knochenmark und der aus ihnen durch Differenzierung entstehenden Blutzellen im Knochenmark und in peripheren Organen.Etwa fünfzig- bis einhunderttausend hämatopoietische Stammzellen (HSC) im gesamten Knochenmark einer Maus (und etwa tausendmal mehr solcher Zellen des Menschen) können entweder langzeitig ruhen (Go) oder sich unter Selbsterneuerung aktiv teilen (G1/S/G2) oder aus- und wieder einwandern und nach Transplantation das ganze blutbildende Zellystem wiederaufbauen (Langzeit-Repopulation, LT-HSC). Alternativ können diese HSC über Zwischenstadien der Differenzierung erst ihre Langzeit-Repopulations-Eigenschaft verlieren, so dass sie nur noch kurzzeitig eine Welle der Differenzierung in allen Blutzellen bewerkstelligen (Short-term, ST-HSC), dann nur noch myeloide und lmphoide Zellen bilden (MPP), sich danach auf myeloide (Common myeloid, CMP) oder lymphoide (Common Lymphoid; CLP) Differenzierung spezialisieren und daraus die verschiedenen reifen Stadien des angeborenen und des adaptiven Immunsystems kontinuierlich nachliefern. Nach einer akuten Infektion mit Mycobakterium tuberculosis und während oft lebenslangen Latenzphasen bei Maus und Mensch sind selektiv in etwa 1% der HSC dormante Formen von Mtb gefunden worden – sind das potentielle Quellen einer späteren aktiven Form von Tuberkulose, und/oder einer kontinuierlichen Produktion von immunisierendem Antigen, das das Immunsystem des Infizierten stimuliert und ihn schützt?
Abb. 3: Kompartimente der hematopoietischen Stammzellen im Knochenmark und der aus ihnen durch Differenzierung entstehenden Blutzellen im Knochenmark und in peripheren Organen.Etwa fünfzig- bis einhunderttausend hämatopoietische Stammzellen (HSC) im gesamten Knochenmark einer Maus (und etwa tausendmal mehr solcher Zellen des Menschen) können entweder langzeitig ruhen (Go) oder sich unter Selbsterneuerung aktiv teilen (G1/S/G2) oder aus- und wieder einwandern und nach Transplantation das ganze blutbildende Zellystem wiederaufbauen (Langzeit-Repopulation, LT-HSC). Alternativ können diese HSC über Zwischenstadien der Differenzierung erst ihre Langzeit-Repopulations-Eigenschaft verlieren, so dass sie nur noch kurzzeitig eine Welle der Differenzierung in allen Blutzellen bewerkstelligen (Short-term, ST-HSC), dann nur noch myeloide und lmphoide Zellen bilden (MPP), sich danach auf myeloide (Common myeloid, CMP) oder lymphoide (Common Lymphoid; CLP) Differenzierung spezialisieren und daraus die verschiedenen reifen Stadien des angeborenen und des adaptiven Immunsystems kontinuierlich nachliefern. Nach einer akuten Infektion mit Mycobakterium tuberculosis und während oft lebenslangen Latenzphasen bei Maus und Mensch sind selektiv in etwa 1% der HSC dormante Formen von Mtb gefunden worden – sind das potentielle Quellen einer späteren aktiven Form von Tuberkulose, und/oder einer kontinuierlichen Produktion von immunisierendem Antigen, das das Immunsystem des Infizierten stimuliert und ihn schützt?

Danksagung

Der Autor dankt der Biologisch-Medizinischen Sektion der Max-Planck-Gesellschaft, dem Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie und dem Präsidium der Max Planck Gesellschaft, für mehr als zwölf Jahre einer noch nie dagewesenen Forschungsunterstützung nach seiner Pensionierung als wissenschaftliches Mitglied des Basler Instituts für Immunologie. Er wurde von 2009 bis 2014 von der Deutschen Forschungsgemeinschaft im Rahmen ihres Koselleck Programms und von der Humboldt-Stiftung mit zwei Humboldt Stipendiaten gefördert.

Literaturhinweise

1.
Seiler, K.; Soroush Noghabi, M.; Karjalainen, K.; Hummel, M.; Melchers, F.; Tsuneto, M.
Induced pluripotent stem cells expressing elevated levels of sox-2, oct-4, and klf-4 are severely reduced in their differentiation from mesodermal to hematopoietic progenitor cells
Stem Cells and Development 20, 1131-1142 (2011)
DOI
2.
Knoll, M.; Simmons, S.; Bouquet, C.; Grün, J. R.; Melchers, F.
miR-221 redirects precursor B cells to the BM and regulates their residence
European Journal of Immunology 43, 2497-2506 (2013)
DOI
3.
Kajikhina, K.; Melchers, F.; Tsuneto, M.
Chemokine polyreactivity of IL7Rα+CSF-1R+ lympho-myeloid progenitors in the developing fetal liver
Scientific Reports 5: 12817 (2015)
DOI
4.
Wolf, I.; Bouquet, C.; Melchers, F.
cDNA-library testing identifies transforming genes cooperating with c-myc in mouse pre-B cells
European Journal of Immunology 46, 2555-2565 (2016)
DOI
5.
Tornack, J.; Reece, S. T.; Bauer, W. M.; Vogelzang, A.; Bandermann, S.; Zedler, U.; Stingl, G.; Kaufmann, S. H.; Melchers, F.
Human and Mouse Hematopoietic Stem Cells Are a Depot for Dormant Mycobacterium tuberculosis
PLOS ONE 12: e0169119 (2017)
DOI
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