Viele wichtige intrazelluläre Botensubstanzen und Signalereignisse weisen innerhalb von lebenden Zellen eine ausgeprägte zeitliche und räumliche Dynamik auf. Besonders Fluktuationen der Konzentration an freiem Kalzium in der Zelle können extrem stark lokalisiert sein und begrenzt auf submikroskopische Mikrodomänen, die unterhalb der Auflösungsgrenze gewöhnlicher Lichtmikroskope liegen, sowie auf membran-umgrenzte Organelle, in die man chemisch synthetisierte Indikatoren nicht spezifisch laden kann. Auf der Ebene des Gesamtorganismus stellt sich das Problem, dass Messungen der Aktivität von Nervenzellen mithilfe der herkömmlichen Patch-Clamp-Techniken auf recht wenige Zellen gleichzeitig begrenzt sind und dass sich biochemische Prozesse nur unter großen Schwierigkeiten im intakten Gewebe messen lassen, da viele Assays es erfordern, das Gewebe vor der Messung aufzuschließen. Dadurch ist weder die Erfassung der zeitlich-räumlichen Dynamik von Signaltransduktionsereignissen noch eine Korrelation mit der initialen Physiologie der Zelle möglich. Nach einigen anhand von morphologischen Kriterien durchgeführten Schätzungen befinden sich aber zum Beispiel im menschlichen Gehirn an die 10.000 verschiedene Typen von Nervenzellen, ausgestattet mit für sie typischen physiologischen Eigenschaften und biochemischen Signalkaskaden, die im Gewebekontext verstanden werden müssen.

Unsere Strategie ist es deshalb, fluoreszierende Sensorproteine zu konstruieren, die uns die Konzentration von Botensubstanzen sowie die Aktivierung von Signalkaskaden sowohl in einzelnen Neuronen als auch in ganzen Verbänden von Nervenzellen im Gehirn anzeigen sollen. Diese Sensorproteine bestehen aus Mutanten des GFP (Grün Fluoreszierendes Protein), die optimiert sind für FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer), und verschiedenen Liganden-bindenden Domänen aus anderen Proteinen, die ihre Konformation nach Bindung des Liganden ändern. FRET ist eine spektroskopische Methode, mit der auf molekularer Ebene Entfernungen und Konformationsänderungen in Proteinen angezeigt werden können.

Dabei wird unter geeigneten Bedingungen ein Teil der Energie des angeregten Zustandes eines Donor-Fluorophores auf ein Empfänger-Fluorophor übertragen. Die Effizienz dieses Prozesses wird quantitativ durch die Förster-Gleichung beschrieben. Die Effizienz des Energietransfers hängt unter anderem von der Entfernung und der Orientierung der beiden Fluorophore zueinander ab. Im Idealfall führt eine Konformationsänderung der Liganden-bindenden Domäne zu einer erhöhten FRET-Effizienz vom Donor- zum Empfänger-GFP (Abb. 1A). In einer anderen Vorgehensweise werden Liganden-bindende Domänen direkt in GFP eingefügt, um durch Bindung des Liganden die Fluoreszenz-Intensität des GFP unmittelbar zu beeinflussen.

Abb. 1: Schematische Repräsentation der Struktur von TN-L15 und Kalzium-Titration des Indikators. A: Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer im genetisch kodierten Kalzium-Indikator TN-L15. Ein Fragment des Skelettmuskel-Troponin C aus dem Huhn wurde zwischen das Donor-GFP CFP und das Empfänger-GFP Citrine fusioniert. Kalziumbindung an Troponin C führt zu einer Konformationsänderung im Protein, das den Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) von CFP zu Citrine verstärkt. Citrine ist eine Mutante des YFP mit verringerter pH- und Chlorid-Sensitivität. B: Kalzium-Titration von TN-L15. Zu sehen ist das Emissionsspektrum von TN-L15 bei verschiedenen Konzentrationen an freiem Kalzium. Eine Erhöhung der Kalzium-Konzentration führt zur Verminderung der CFP-Emission bei 476 nm und zur Erhöhung der Citrine-Emission bei 528 nm.

Genetische Indikatoren zeigen eine Reihe von Vorteilen gegenüber herkömmlichen synthetischen Indikatoren wie zum Beispiel fura-2 oder der fluo-Serie. Sie werden nach Transfektion in situ direkt in der Zelle erzeugt und benötigen keine Kofaktoren. Sie können mittels molekularbiologischer Techniken präzise in Organellen oder anderen zellulären Mikroumgebungen lokalisiert werden und verbleiben selbst in sehr lang andauernden Experimenten in den Zellen. Mittels spezifischer Promotoren können transgene Indikatororganismen erzeugt werden, die den Indikator beispielsweise in Subtypen von Nervenzellen und definierten neuronalen Ensembles exprimieren. Schließlich bietet sich damit im Prinzip die Möglichkeit, Indikatoren für andere organische Botensubstanzen (wie zum Beispiel cAMP oder IP3) zu konstruieren, die in ihrer Struktur zu komplex sind, um dafür durch chemische Synthese spezifische Reporter-Moleküle herzustellen. Da Konformationsänderungen und Protein-Protein-Interaktionen in der Natur weit verbreitet sind und unser Wissen über funktionelle Proteinmodule ständig zunimmt, bietet sich eine Reihe von Möglichkeiten zum Design neuartiger Reportermoleküle für Signaltransduktion, Transkriptionsfaktor-Induktion, Rezeptoraktivierung usw.

Um neue Calciumindikatoren zu generieren, benutzten wir Varianten von Troponin C – dem Calciumsensor in Skelett- und Herzmuskel - und fusionierten sie in geeigneter Weise zwischen CFP (Cyan Fluoreszierendes Protein) als Donor und YFP (Yellow - gelb - Fluoreszierendes Protein) als Empfänger (Abb. 1A). Die Calciumbindung an Troponin C führt zu einer starken Konformationsänderung im Protein, wodurch die daran fusionierten CFP und YFP neu zueinander positioniert werden. Dadurch verstärkt sich der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer von CFP zu YFP. Das Verhältnis der beiden Emissionen zueinander dient als Maß der freien Calciumkonzentration. Die Abhängigkeit des Emissionsverhältnisses des von uns entwickelten Indikators TN-L15 von der freien Calciumkonzentration ist in Abbildung 1B zu sehen. TN-L15 hat einen Kd von etwas unter einem µM und ist damit sehr gut geeignet, um Calciumfluktuationen im Cytosol einer Vielzahl von lebenden Zellen zu messen. Da Troponin C eigentlich Teil des Troponin-Komplexes ist und nicht frei im Cytosol vorkommt, war es unklar, ob sich davon abgeleitete Indikatoren gut in Zellen exprimieren lassen. Es zeigte sich jedoch, dass die Expression von TN-L15 im Cytosol von HEK 293-Zellen sehr gleichförmig und homogen ist und es keinerlei Anzeichen für Aggregation oder unspezifische Bindung an cytosolische Komponenten gibt (Abb. 2A). Calcium-Imaging mit dem Indikator ist dynamisch, quantitativ und gut reproduzierbar. Abbildung 2B zeigt ein Imaging-Experiment mit einer HEK 293-Zelle. Es sind lang andauernde Calcium-Oszillationen zu sehen, die sich nach Stimulation muskarinischer Rezeptoren mit dem Acetylcholin-Analog Carbachol über mehr als eine Stunde erstrecken, gefolgt von einer Kalibration des Indikators in vivo durch Ionomycin/10 mM CaCl₂ und Ionomycin/10 mM EGTA, um R_max und R_min zu ermitteln. Im Augenblick arbeiten wir daran, die subzellulären Targeting-Eigenschaften des Indikators zu untersuchen. Calcium ist nicht nur eine wichtige Botensubstanz, sondern der Einstrom von Calcium ist indirekt auch ein Maß für neuronale Aktivität. Deshalb sind wir daran interessiert, TN-L15 als synaptischen Aktivitätssensor entweder prä- oder postsynaptisch einzusetzen. Weitere Arbeiten bestehen darin, transgene Indikatororganismen herzustellen, die TN-L15 unter der Kontrolle von spezifischen Promotoren im Gehirn exprimieren. Untersuchungen an transgenen Fliegen, Zebrafischen und Mäusen sind bereits in Arbeit. Die erfolgreiche Entwicklung von genetisch-kodierten Sensoren zu routinemäßig einsetzbaren Werkzeugen wird unsere experimentellen Möglichkeiten deutlich erweitern. Die komplementäre Klonierung von neuen GFPs aus anderen Seeorganismen sowie innovative Methoden, um Indikatoren mittels Prinzipien molekularer Evolution herzustellen, sollten uns neuartige Werkzeuge in die Hand geben, um die Physiologie und Biochemie lebender Zellen besser zu verstehen.

Abb. 2: Kalzium-Imaging mit dem genetisch kodierten Indikator TN-L15. A: Fluoreszenz-Bild von HEK293-Zellen, die transient mit der Indikator-DNA transfiziert wurden. Emission 535/25 nm. B: Lang anhaltende Kalzium-Oszillationen in einer HEK293-Zelle nach Stimulation mit Carbachol.