Forschungsbericht 2009 - Max-Planck-Institut für chemische Ökologie

Herbivore Insektenlarven: Verdauung und Immunität

Digestion and immunity in herbivorous insect larvae

Autoren
Heckel, David G.; Freitak, Dalial; Pauchet, Yannick; Vogel, Heiko
Abteilungen

Entomologie (Prof. David G. Heckel)
MPI für chemische Ökologie, Jena

Zusammenfassung
Pflanzenfressende Insekten begegnen in ihrer Umgebung vielen unterschiedlichen Stressfaktoren. Ihr Verdauungssystem muss mit Giften fertig werden, die von Wirtspflanzen zur Verteidigung gegen Insektenbefall gebildet werden, und ihr Immunsystem muss sich gegen Angriffe von Erregern und Parasiten zur Wehr setzen. Wissenschaftler am Max-Planck-Institut für chemische Ökologie haben herausgefunden, dass diese beiden physiologischen Systeme – Verdauung und Immunität – auf unerwartete Weise zusammenarbeiten.
Summary
Herbivorous insects encounter many different types of stresses in their environment. The digestive system must cope with toxins made by their host plants to defend against herbivory, and the immune system must defend against attack by pathogens and parasites. Scientists from the Max Planck Institute for Chemical Ecology have discovered that these two physiological systems – digestion and immunity – interact in some unexpected ways.

Einführung

Ein Mottenweibchen fliegt von Pflanze zu Pflanze, um einen geeigneten Wirt für seinen Nachwuchs zu suchen. Es trifft seine Wahl und legt eines seiner Eier vorsichtig auf einem Blatt ab. Sobald die winzige Raupe aus dem Ei schlüpft, wird sie allerdings mit einer anspruchsvollen Aufgabe in einer nicht unbedingt wohlgesonnenen Umgebung konfrontiert: Sie muss genug Pflanzenmaterial aufnehmen und verdauen, um ihr Körpergewicht am Ende um das 200-fache zu erhöhen. Gleichzeitig muss sie den Cocktail giftiger Substanzen, den die Pflanze produziert, um sich gegen Fraßangriffe von Insekten zu wehren, entgiften oder vermeiden. Außerdem muss sie darauf achten, nicht selbst zur Beute anderer Lebewesen zu werden, sei es durch eine Infektion mit Viren oder Bakterien oder indem sie von der Larve eines anderen Insekts, beispielsweise einer parasitoiden Wespe oder Fliege, von innen aufgefressen wird. Wie meistert die frisch geschlüpfte pflanzenfressende Larve diese Herausforderungen? Sie bildet Enzyme in ihrem Verdauungstrakt, um ihre Nahrung zu entgiften und zu verdauen, und sie aktiviert ihre Immunabwehr gegen Organismen, die versuchen, in sie einzudringen. Obwohl sie für völlig unterschiedliche Aufgaben bestimmt zu sein scheinen, können Verdauungs- und Immunsystem auf überraschende Weise miteinander interagieren. Dies konnte aus neuen Untersuchungen am Kohlspanner Trichoplusia ni und verwandten Arten gefolgert werden.

Das Immunsystem der Insekten

In den letzten 20 Jahren haben die Forschungsarbeiten zum Immunsystem der Insekten, insbesondere im Modellorganismus Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) [1], nahezu explosionsartig zugenommen. Obwohl Insekten nicht über ein adaptives Immunsystem wie das der Wirbeltiere verfügen, das heißt, sie nicht in der Lage sind, bei Exposition gegenüber Antigenen spezielle Antikörper zu bilden, haben sie ein vielfältiges und effektives angeborenes Immunsystem, das viele Ähnlichkeiten zum angeborenen Immunsystem von Wirbeltieren aufweist. So bilden Insekten Proteine mit antiviraler und antimykotischer Wirkung, darunter einige der wirksamsten antibakteriellen Peptide, die bekannt sind. Die Synthese dieser Proteine wird erheblich durch Mustererkennungsmoleküle verstärkt, die sich auf bestimmte molekulare Merkmale der Zellwand von Bakterien oder Pilzen richten und somit Erreger gewissermaßen entdecken können. In der Hämolymphe (dem Blut) von Insekten wiederum kann das Phenoloxidase- Enzymnetzwerk sofort nach Befall aktiv werden, indem es Melanin bildet, um Fremdkörper abzufangen und zum Gerinnen zu bringen. Und auch Hämozyten (Blutzellen) stehen bereit, um winzige Eindringlinge wie zum Beispiel Bakterien einzuhüllen und zu zerstören oder größere Invasoren wie parasitoide Eier zu umschließen und einzukapseln [1].

Die meisten dieser Verteidigungsmechanismen sowie die experimentellen Paradigmen, die für deren Untersuchung zugrunde gelegt wurden, konzentrieren sich auf Eindringlinge, die in den Körper der Larven gelangen, sobald die Oberhaut – also das äußere schützende Skelett aus Chitin – aufgebrochen wird. Aber eine hungrige Larve ist auch und besonders verwundbar durch die Invasion über einen anderen Weg: die große Menge an Futter, die täglich ihr Verdauungssystem passiert. Tatsächlich sind einige Bakterien und Viren darauf spezialisiert, Zellen im Mitteldarm zu töten, nachdem sie vom Insekt zusammen mit dessen Nahrung verschlungen wurden. Bacillus thuringiensis und das Granulovirus CpGV sind typische Vertreter solcher Insektenpathogene, und tatsächlich werden sowohl B. thuringiensis als auch CpGV besonders im biologischen Pflanzenschutz gegen Schadinsekten eingesetzt. Allerdings führte ihr beständiger Einsatz in der Landwirtschaft bereits zur Entwicklung von Resistenzen bei den Fraßfeinden [2, 3]. Da Pflanzenoberflächen grundsätzlich mit Bakterien und Pilzen besiedelt sind, kann man davon ausgehen, dass ein fortwährender Strom von pathogenen und nicht-pathogenen Mikroorganismen durch das Verdauungssystem von herbivoren Insekten fließt. Damit stellte sich die Frage, ob Insekten eine Möglichkeit haben, diesen Strom von mikrobiellen Erregern zu überwachen, und wie ein Insekt reagiert, wenn der Strom noch erheblich zunimmt.

Der Kohlspanner Trichoplusia ni

Wenn Larven des Kohlspanners Trichoplusia ni (Abb. 1) täglich eine Mischung aus nicht-pathogenen grampositiven und gramnegativen Bakterien zusammen mit einer künstlichen Nahrung erhalten, können starke Immunreaktionen beobachtet werden, sogar wenn die Insekten äußerlich nahezu unbeeinträchtigt durch die kontaminierte Kost erscheinen [4]. Die Behandlung führt lediglich zu einer etwas verlängerten Zeit bis zur Verpuppung und einem etwas verringerten Puppengewicht. Dennoch nimmt die Konzentration von antimikrobiellen Peptiden in der Hämolymphe zu. Diese Konzentrationserhöhung könnte vor einer weiteren Invasion mikrobieller Erreger schützen, die möglicherweise vom Mitteldarm in die Hämolymphe gelangen könnten. Interessanterweise wird gleichzeitig das enzymatische Phenoloxidase-System verlangsamt, was die Immunabwehr gegen parasitoide Eier reduziert. Dieses „Tauschgeschäft“ stellt eine Möglichkeit dar, das Budget auszugleichen: Immerhin kosten Immunreaktionen viel Energie. Weiterhin wird die Expression einer großen Anzahl von Genen, die in Studien nachweislich für die Reaktion auf bakterielle Infektion oder Verwundung verantwortlich gemacht wurden, nach der Fütterung bakterieller Kost gesteigert [5]. Dies bedeutet, dass das Insekt in irgendeiner Form das Vorhandensein von Bakterien im Mitteldarm wahrnimmt und Immunantworten in der Hämolymphe und anderen Körperregionen aktiviert, so als ob die Bakterien auch dort gegenwärtig wären. Die Mechanismen dieser interzellulären Kommunikation sind derzeit noch nicht bekannt. Auffallend ist, dass viele der Gene, die auf die Fütterung mit Bakterien reagiert haben, nach Puppenstadium und Metamorphose im adulten Stadium des Insekts in ihrer Expression immer noch hochreguliert sind.

Diese letztere Beobachtung machte die Forscher neugierig, und es stellte sich die Frage, ob die Immunantworten sogar noch länger fortbestehen könnten. Adulte Motten, die entweder in ihrem Larvenstadium Bakterien als Nahrung erhalten hatten oder nicht, wurden in allen Kombinationen gepaart, und die Nachkommen wurden mit künstlicher Nahrung ohne Bakterien aufgezogen. Überraschenderweise zeigten auch diese Nachkommen Veränderungen in ihren Immunreaktionen, und zwar in Abhängigkeit von den Erfahrungen ihrer Eltern [6]: Antibakterielle Peptide in der Hämolymphe wurden vermehrt in denjenigen Larven gefunden, deren Eltern Bakterien konsumiert hatten. Die Phenoloxidase-Aktivität in diesen Larven war ebenfalls erhöht und zeigte damit einen gegenläufigen Trend im Vergleich zu den Eltern. Und viele der Gene, die in den Eltern, die bakterielle Kost erhielten, hochreguliert waren, waren in den Nachkommen ebenfalls hochreguliert, während andere Gene stattdessen herunterreguliert waren. Diese Beobachtungen weisen eine hohe Evidenz für einen generationsübergreifenden Effekt aus, der das Immunsystem der Nachkommen gemäß den Erfahrungen der Eltern prägt. Jedoch handelt es sich bei den Nachkommen um eine andere Art von Immunantwort und nicht um eine Kopie der elterlichen Immunreaktion auf den ursprünglichen bakteriellen Stimulus [6]. Ein ähnliches Phänomen wird als trans-generational immune priming bezeichnet und konnte in anderen Insektenarten beobachtet werden. Allerdings ist in all diesen Fällen der Mechanismus der Informationsübertragung auf die nächste Generation vollkommen unbekannt.

Molekulare Erkennung von Insektenpathogenen

Wie aber kann ein Insekt, das eine vermehrte Bakterienbesiedlung im Mitteldarm direkt erlebt, die Anwesenheit von Bakterien bemerken und entsprechend seine Immunabwehr aktivieren? Erste Hinweise wurden durch eine umfassende Analyse derjenigen Proteine erhalten, die in das Lumen (den zentralen Hohlraum) des Mitteldarms abgesondert werden. Neben typischen Verdauungsenzymen, wie beispielsweise Proteasen, Lipasen und Sucrasen, wurde ein Protein gefunden, das eine Ähnlichkeit zu β-Glucan-Erkennungsproteinen (β-glucan recognition proteins, β-GRPs) in Insekten aufweist [7]. β-1,3-Glucan-Bindungen zwischen Zuckern sind charakteristisch für mikrobielle Zellwände, und von β-Glucan-Erkennungsproteinen aus Insekten weiß man, dass diese an β-1,3-Glucan-Bindungen andocken können. Tatsächlich konnte mithilfe von Kurdlan, einem unlöslichen Kohlenhydrat, das β-1,3-Glucan-Bindungen enthält, ein Proteinkomplex aus der Hämolymphe isoliert werden, bestehend aus β-GRP, einer katalytisch inaktiven Prophenoloxidase sowie verschiedenen Proteasehemmern. Dieser Proteinkomplex ist es, der in Anwesenheit des Pathogens aktiviert wird und im Anschluss an das Andocken von β-GRP an β-1,3-Glucan-Bindungen der bakteriellen Zellwände aktive Phenoloxidase freisetzt. Die Entdeckung eines β-GRP-Proteins im Mitteldarm legte nahe, dass womöglich auch im Lumen ein solcher Komplex existiert. Allerdings konnte der Einsatz der Kurdlan-Methode zur Isolierung adäquater Proteine aus dem Lumen diese Annahme nicht bestätigen; nur das bereits identifizierte β-GRP-Protein war nachweisbar. Nachdem das β-GRP-Protein heterolog in Bakterien exprimiert worden war, stellte sich interessanterweise heraus, dass es sich bei dem Protein zusätzlich um eine katalytisch aktive Glucanase handelt, die neben dem Andocken an β-1,3-Glucan-Bindungen genau diese Bindungen auch spalten (hydrolysieren) kann [8]. Eine vergleichende Sequenzanalyse zeigte, dass eine ähnlich aktive Glucanase auch im Mitteldarm vieler anderer Schmetterlingsarten zu finden ist (Abb. 2).

Wann wird die Immunreaktion im Insekt ausgelöst?

Wir nehmen an, dass die β-1,3-Glucanase-Aktivität der β-GRPs, statt nur Bakterien direkt durch Andocken aufzuspüren, konstant und langsam das aktivierende Signal der β-1,3-Glucan-Bindungen abschwächt. Dies würde nämlich die Aktivierung des Immunsystems des Insekts durch harmlose symbiotische Bakterien, die im Mitteldarm leben, sowie durch kleine Mengen von Bakterien, die mit der Nahrung aufgenommen werden, verhindern. Wenn das Insekt allerdings plötzlich mit größeren Mengen an Bakterien konfrontiert wird, bleiben viele β-1,3-Glucan-Bindungen auf deren Zellwänden von der Spaltung verschont und können so eine Immunreaktion auslösen. Für die Amidase PGRP-LB wird eine ähnliche Rolle vermutet: Das Enzym baut im Mitteldarm von Drosophila-Larven Peptidoglycane ab, einen anderen wesentlichen Bestandteil bakterieller Zellwände [9].

Da Immunantworten bei Insekten sehr stark ausfallen und sogar in der nachfolgenden Generation fortbestehen können, scheint es wichtig zu sein, ihre Aktivierung zunächst zu vermeiden, es sei denn, der Grad der Bedrohung ist hoch genug, um die signalunterdrückenden Aktivitäten der Glucanasen oder Amidasen zu überwinden. Wenn also Wirtspflanzen Glucanase-Hemmstoffe in ihren Anti-Herbivoren-Cocktail aufnehmen würden, wären Insekten gezwungen, eine kostenintensive Immunreaktion bereits bei niedrigen Mengen an Bakterien auszulösen und würden dabei infolge des Fressens an der Pflanze einen Fitnessverlust erleiden. Dies ist ein unerwarteter neuer Aspekt der Wechselwirkungen zwischen Verdauungs- und Immunsystem, die die Larve vorsichtig ausbalancieren muss, um erfolgreich das Entwicklungsstadium einer erwachsenen Motte zu erreichen – die dann mit ihrer Eiablage auf die nächste Generation von Wirtspflanzen den Kreislauf wieder von vorne beginnt.

Originalveröffentlichungen

B. Lemaitre, J. Hoffmann:
The host defense of Drosophila melanogaster.
Annual Review of Immunology 25, 697-743 (2007).
L. Gahan, F. Gould, D. G. Heckel:
Identification of a gene associated with Bt resistance in Heliothis virescens.
Science 298, 857-860 (2001).
S. Asser-Kaiser, S. E. Fritsch, K. Undorf-Spahn, J. Kienzle, K. E. Eberle, N. A. Gund, A. Reineke, C. P. W. Zebitz, D. G. Heckel, J. Huber, J. A. Jehle:
Rapid emergence of baculovirus resistance of codling moth due to sex-linkage and concentration-dependent dominance.
Science 317, 1916-1918 (2007).
D. Freitak, C. W. Wheat, D. G. Heckel, H. Vogel:
Immune system responses and fitness costs associated with consumption of bacteria in larvae of Trichoplusia ni.
BMC Biology 5:56 (2007).
D. Freitak, D. G. Heckel, H. Vogel:
Bacterial feeding induces changes in immune-related gene expression and has trans-generational impacts in the cabbage looper Trichoplusia ni.
Frontiers in Zoology 6:7 (2009).
D. Freitak, D. G. Heckel, H. Vogel:
Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore.
Proceedings of the Royal Society B - Biological Sciences 276, 2617-2624 (2009).
Y. Pauchet, A. Muck, A. Svatos, D. G. Heckel, S. Preiß:
Mapping the larval midgut lumen proteome of Helicoverpa armigera, a generalist herbivorous insect.
Journal of Proteome Research 7, 1629-1639 (2008).
Y. Pauchet, D. Freitak,; H. Heidel-Fischer, D. G. Heckel, H. Vogel:
Glucanase activity in a glucan-binding protein family from Lepidoptera.
Journal of Biological Chemistry 284, 2214-2224 (2009).
A. Zaidman-Rémy, M. Hervé, M. Poidevin, S. Pili-Floury, M. S. Kim, D. Blanot, R. Ueda, D. Mengin-Lecreulx, B. Lematre:
The Drosophila amidase PGRP-LB modulates the immune response to bacterial infection.
Immunity 24, 463-473 (2006).
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